检测传染性造血器官坏死病的试剂盒及其检验方法技术

本发明专利技术提供一种检测传染性造血器官坏死病的试剂盒，其适用于聚合酶连锁反应，试剂盒包含引物对，引物对包含如序列标记编号1所示的正向引物和序列标记编号2所示的反向引物。本发明专利技术另提供一种利用上述试剂盒检测传染性造血器官坏死病的检验方法。由此，可以快速且特异性的从待测样本中检测传染性造血器官坏死病。

A Kit for Detecting Infectious Hematopoietic Necrosis and Its Test Method

【技术实现步骤摘要】
检测传染性造血器官坏死病的试剂盒及其检验方法
本专利技术是有关一种核酸的测定和检验方法，特别是有关于一种利用聚合酶连锁反应检测传染性造血器官坏死病的试剂盒及其检验方法。
技术介绍
传染性造血器官坏死病是一种感染冷水鱼的病毒性疾病。宿主主要为鲑科鱼类，例如虹鳟和大西洋鲑，当传染性造血器官坏死病爆发时，首先出现稚鱼和幼鱼的死亡率突然升高。受侵害的鱼通常出现昏睡症状，不愿活动和避开水流，但也有的鱼表现狂暴乱窜、打转等反常现象。患病鱼眼球突出且变黑、腹部膨胀，以及肛门处拖着不透明或棕褐色的假管型粘液粪便是较为典型的特征，但并非该病所独有。鱼鳃苍白，鳍基部出血。另外，通常在头部的后的侧线上方显示皮下出血。传染性造血器官坏死病的病原为传染性造血器官坏死病病毒(InfectiousHaematopoieticNecrosisVirus,IHNV)，隶属于弹状病毒科(Rhabdoviridae)粒外弹状病毒属(Novirhabdovirus)，为一单股反义RNA病毒，基因组大小为11130bp。其形态呈子弹状，长度约为160-180nm，直径约为70-90nm，有15nm厚的囊膜。传染性造血器官坏死病病毒的基因组自3’端至5’端依次编码核蛋白(nucleoprotein,N)、磷蛋白(phosphoprotein,P)、基质蛋白(matrixprotein,M)、糖蛋白(glycoprotein,G)、非结构蛋白(non-virionprotein,NV)和聚合酶蛋白(polymerase,L)。传染性造血器官坏死病感染的鱼只的死亡情形与鱼年龄有相当密切的关系，一般幼鱼对病毒相当敏感，较大的鱼具有某程度的抵抗力。好的环境可降低本病的危害。于自然环境下，传染性造血器官坏死病主要发生的水温为8-15℃的间，其死亡率与环境温度、病毒株(virusstrain)等皆有关，如严重时通常其累计死亡率(cumulativemortality)可高达90-95％。如变成慢性(chroniccases)则通常各种病程皆可被观察到，疾病感染中如再继发二次性的细菌感染通常死亡是会相当严重。因此开发快速、方便及准确检测传染性造血器官坏死病的试剂盒及其检验方法，以方便传染性造血器官坏死病的现场或实验室检测至为关键。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的一目的是提供一种检测传染性造血器官坏死病的试剂盒及其检测方法，可以快速且特异性的自待测样本中检测传染性造血器官坏死病。本专利技术的一方案是提供一种检测传染性造血器官坏死病的试剂盒，其包含一引物对，所述引物对包含一序列标记编号1所示的正向引物以及一序列标记编号2所示的反向引物。依据前述的检测传染性造血器官坏死病的试剂盒，可进一步包含一反转录聚合酶连锁反应所需的试剂。依据前述的检测传染性造血器官坏死病的试剂盒，可进一步包含一如序列标记编号3所示的萤光探针。本专利技术的另一方案是在提供一种检测传染性造血器官坏死病的检验方法，包含以下步骤。提供一待测样本作为一模板。将所述模板进行一反转录聚合酶连锁反应，以获得一cDNA模板。将cDNA模板以前段所述的检测传染性造血器官坏死病的试剂盒进行聚合酶连锁反应，以获得一聚合酶连锁反应产物，而所述检测传染性造血器官坏死病的试剂盒包含一引物对，所述引物对包含序列标记编号1所示的正向引物以及序列标记编号2所示的反向引物。最后检测所述聚合酶连锁反应产物的分子量大小是否为98bp。依据前述的检测传染性造血器官坏死病的检验方法，其中，所述聚合酶连锁反应产物可具有如序列标记编号4所示的序列。依据前述的检测传染性造血器官坏死病的检验方法，其中，检测所述聚合酶连锁反应产物可以胶体电泳系统进行。本专利技术的又一方案是在提供一种检测传染性造血器官坏死病的检验方法，包含以下步骤。提供一待测样本作为一模板。将所述模板进行一反转录聚合酶连锁反应，以获得一cDNA模板。将cDNA模板以前段所述的检测传染性造血器官坏死病的试剂盒进行一萤光探针式聚合酶连锁反应，而所述检测传染性造血器官坏死病的试剂盒包含一引物对和一萤光探针，所述引物对包含序列标记编号1所示的正向引物和序列标记编号2所示的反向引物，所述萤光探针具有如序列标记编号3所示的序列。最后检测是否具有一萤光信号值。依据前述的检测传染性造血器官坏死病的检验方法，其中所述萤光探针式聚合酶连锁反应可为即时聚合酶连锁反应(Real-timePCR)或隔绝恒温式聚合酶连锁反应(insulatedisothermalPCR,iiPCR)。本专利技术的再一方案是提供一种检测传染性造血器官坏死病的检验方法，包含以下步骤。提供一待测样本作为一模板。将所述模板以前段所述的检测传染性造血器官坏死病的试剂盒依序进行一反转录聚合酶连锁反应和一DNA扩增反应。所述检测传染性造血器官坏死病的试剂盒为预混形式，其包含一引物对、一反转录聚合酶连锁反应所需的试剂及/或一萤光探针，所述引物对包含序列标记编号1所示的正向引物和序列标记编号2所示的反向引物，所述萤光探针具有如序列标记编号3所示的序列。而所述DNA扩增反应为一聚合酶连锁反应或一萤光探针式聚合酶连锁反应。最后检测是否具有一预期聚合酶连锁反应产物。DNA扩增反应为聚合酶连锁反应时，当一聚合酶连锁反应产物的分子量大小为98bp时，为具有预期聚合酶连锁反应产物的表征。DNA扩增反应为萤光探针式聚合酶连锁反应时，一萤光信号值为具有预期聚合酶连锁反应产物的表征。依据前述的检测传染性造血器官坏死病的检验方法，其中，所述萤光探针式聚合酶连锁反应可为即时聚合酶连锁反应或隔绝恒温式聚合酶连锁反应。由此，本专利技术的检测传染性造血器官坏死病的试剂盒及其检验方法，能快速、特异、方便且准确地检测待测样本中是否存在传染性造血器官坏死病病毒，显示待测样本已感染传染性造血器官坏死病。本专利技术的检测传染性造血器官坏死病的试剂盒及其检验方法的检测结果除了可经由一般常规跑胶确认结果外，也可进行萤光聚合酶连锁反应及隔绝恒温式聚合酶连锁反应确认结果，其中尤其隔绝恒温式聚合酶连锁反应的检测结果不需复杂的资料判读，即使未受过专业训练的人员，也能利用本专利技术的试剂盒及检验方法进行传染性造血器官坏死病的检测，并用于田野间水产养殖渔业的检测，能快速且准确的诊断病原感染以供提早防治。上述
技术实现思路
旨在提供本公开内容的简化摘要，以使阅读者对本公开内容具备基本的理解。此
技术实现思路
并非本公开内容的完整概述，且其用意并非在指出本专利技术实施例的重要/关键元件或界定本专利技术的范围。附图说明为让本专利技术的上述和其他目的、特征、优点与实施例能更明显易懂，对附图的说明如下。图1表示依照本专利技术的一实施方式的检测传染性造血器官坏死病的试剂盒的结构示意图。图2表示本专利技术的另一实施方式的检测传染性造血器官坏死病的检验方法的步骤流程图。图3表示本专利技术的又一实施方式的检测传染性造血器官坏死病的检验方法的步骤流程图。图4表示本专利技术的又一实施方式的检测传染性造血器官坏死病的检验方法的步骤流程图。图5为本专利技术的检测传染性造血器官坏死病的试剂盒的检测特异性分析结果图。图6为本专利技术的检测传染性造血器官坏死病的试剂盒的检测灵敏度分析结果图。图7为本专利技术的检测传染性造血器官坏死病的试剂盒进行隔绝恒温式聚合酶连锁反应的胶体电泳分析图。其中，附图标记本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测传染性造血器官坏死病的试剂盒，其特征在于，其包含一引物对，该引物对包含一序列标记编号1所示的正向引物、以及一序列标记编号2所示的反向引物。

【技术特征摘要】
2018.03.02 CN 20182029415881.一种检测传染性造血器官坏死病的试剂盒，其特征在于，其包含一引物对，该引物对包含一序列标记编号1所示的正向引物、以及一序列标记编号2所示的反向引物。2.如权利要求1所述的检测传染性造血器官坏死病的试剂盒，其中，其进一步包含一序列标记编号3所示的萤光探针。3.如权利要求1或2所述的检测传染性造血器官坏死病的试剂盒，其中，其进一步包含一反转录聚合酶连锁反应所需的试剂。4.一种检测传染性造血器官坏死病的检验方法，其特征在于，其包含：提供一待测样本作为一模板；将该模板进行一反转录聚合酶连锁反应，以获得一cDNA模板；将该cDNA模板以权利要求1所述的试剂盒进行一聚合酶连锁反应，以获得一聚合酶连锁反应产物；以及检测该聚合酶连锁反应产物的分子量大小是否为98bp。5.如权利要求4所述的检测传染性造血器官坏死病的检验方法，其中，该聚合酶连锁反应产物具有序列标记编号4所示的序列。6.权利要求4项所述的检测传染性造血器官坏死病的检验方法，其中，检测该聚合酶连锁反应产物是通过一胶体电泳系统来进行。7.一种检测传染性...

【专利技术属性】
技术研发人员：于力，黄建德，王津津，刘荭，何燕华，贾鹏，段雪昆，郑晓聪，邱莞思，林成贤，
申请(专利权)人：深圳出入境检验检疫局食品检验检疫技术中心，金瑞鸿捷厦门生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44