一种乙酰羟酸合成酶及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一个解除L‑异亮氨酸反馈抑制乙酰羟酸合成酶及其应用，属于代谢工程领域。本发明专利技术所述ilvBN

A Kind of Acetyl Hydroxylate Synthase and Its Application

【技术实现步骤摘要】
一种乙酰羟酸合成酶及其应用
：本专利技术涉及一个解除L-异亮氨酸反馈抑制乙酰羟酸合成酶及其应用，属于代谢工程领域。
技术介绍
：L-异亮氨酸属于分支链氨基酸，是人体必需的八种氨基酸之一。L-异亮氨酸是合成人体激素和酶的原料，具有促进蛋白质合成和抑制其分解的作用，在人体生命活动中扮演着至关重要角色。因此，L-异亮氨酸在食品和医药等行业具有非常广泛的市场及应用前景。L-异亮氨酸的合成方法有提取法、化学合成法和发酵法。工业化生产主要采用毛发提取法和发酵法合成L-异亮氨酸。由于提取法具有原料来源受限制、生产成本高、污染环境等不足，目前主要采用发酵法生产L-异亮氨酸。目前，L-异亮氨酸的工业生产菌种主要由诱变获得，具有营养缺陷、生长慢、遗传性状不稳定等不足，从而引起发酵周期长、发酵性能不稳定、产量和转化率低等问题。
技术实现思路
：为了克服目前野生型乙酰羟酸合成酶受L-异亮氨酸反馈抑制的不足，本专利技术提供一种解除L-异亮氨酸反馈抑制的乙酰羟酸合成酶突变体及其编码基因及其应用。本专利技术解决述问题的技术方案之一是：提供一个解除L-异亮氨酸反馈抑制的乙酰羟酸合成酶突变体，具有SEQIDNO.1所示的氨基酸序列，所述乙酰羟酸合成酶突变体的编码基因为ilvBNM，核苷酸序列如序列表SEQIDNO.2所示。所述乙酰羟酸合成酶突变体来自一株谷氨酸棒杆菌突变株，所述突变株筛选过程如下：以谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)ATCC13032为出发菌株，通过常压室温等离子诱变，然后在含50mg/Lα-氨基丁酸的基本培养基上筛选出菌株ILE396；以ILE396为出发菌株，通过常压室温等离子诱变，然后在含50mg/L硫代异亮氨酸的基本培养基上筛选出菌株ILE693。提取ILE693基因组，通过设计引物进行PCR扩增乙酰羟酸合成酶编码基因，将PCR产物回收后进行测序，发现该基因编码的乙酰羟酸合成酶相对于来自谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)ATCC13032的野生型乙酰羟酸合成酶发生如下氨基酸突变：K30Q，A84T，G128S，A226S，K227R，Y252H，T362S，H673L。在本专利技术中采用如下定义：1、氨基酸和DNA核酸序列的命名法使用氨基酸残基的公认IUPAC命名法，采用三字母代码形式。DNA核酸序列采用公认IUPAC命名法。2、乙酰羟酸合成酶突变体的标识采用“原始氨基酸位置替换的氨基酸”来表示乙酰羟酸合成酶突变体中突变的氨基酸。如K30Q，表示位置30的氨基酸由野生型乙酰羟酸合成酶的Lys替换成Gln，K30表示第30位的氨基酸为Lys，位置的编号对应于SEQIDNO.3中野生型乙酰羟酸合成酶的氨基酸序列编号。本专利技术中，ilvBN代表野生型乙酰羟酸合成酶编码基因(SEQIDNO.4所示)，ILVBN代表野生型乙酰羟酸合成酶(SEQIDNO.3所示)；ilvBNM为乙酰羟酸合成酶突变体基因(SEQIDNO.2所示)；ILVBNM为乙酰羟酸合成酶突变体(SEQIDNO.1所示)。突变前后的氨基酸对照如下表：乙酰羟酸合成酶氨基酸ILVBNK30，A84，G128，A226，K227，Y252，T362，H673ILVBNMK30Q，A84T，G128S，A226S，K227R，Y252H，T362S，H673L所述乙酰羟酸合成酶突变体ILVBNM，具有如下酶学特性：在L-异亮氨酸浓度为0-12mmol/L条件下，ILVBNM酶活性无明显变化，即该突变体解除了L-异亮氨酸对其反馈抑制作用；且在L-异亮氨酸浓度为0-12mmol/L条件下，ILVBNM的酶活性与野生型乙酰羟酸合成酶ILVBN相比无降低。本专利技术还提供乙酰羟酸合成酶突变体ILVBNM在生产L-异亮氨酸中的应用。有益效果：1、本专利技术所述ilvBNM基因编码的乙酰羟酸合成酶具有如下特点：该酶在解除了L-异亮氨酸对其的反馈抑制作用(图1)，在L-异亮氨酸浓度为0-12mmol/L条件下，ILVBNM酶活性无明显变化，且其活性较野生型ilvBN编码的乙酰羟酸合成酶未见明显降低(图2)。附图说明：图1L-异亮氨酸对ilvBN和ilvBNM基因编码的乙酰羟酸合酶活性的影响；图2ilvBNM与ilvBN编码的乙酰羟酸合酶活性对比；具体实施方式：为了使本专利的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本专利进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本专利，并不用于限定本专利技术。实施例1：解除L-异亮氨酸反馈抑制的乙酰羟酸合成酶编码基因ilvBNM的获得(1)抗L-异亮氨酸结构类似物突变株的筛选①谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)ATCC13032菌悬液的制备将谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)ATCC13032接种至LB液体培养基，于32℃，200rpm，培养12h，离心收集菌体，无菌生理盐水洗涤3次后重悬，使得OD600＝0.6-0.8，取10μL菌悬液涂在载片上。②常压室温等离子诱变诱变参数为：载片置于气流端口2mm处，功率120W，气流量10SLM，作用时间25s。③抗L-异亮氨酸结构类似物α-氨基丁酸突变株的筛选将步骤②诱变后的菌悬液涂布在含50mg/Lα-氨基丁酸的基本培养基上，35℃培养48h后，选取菌落较大的菌株。④菌株产L-异亮氨酸能力测定将步骤③筛选的菌株利用种子培养基进行96孔板培养，然后以10％的接种量接种至含发酵培养基的96孔板进行发酵实验，ILE396的L-异亮氨酸产量最高。⑤抗L-异亮氨酸结构类似物硫代异亮氨酸突变株的筛选及产L-异亮氨酸能力测定以ILE396为诱变对象，重复步骤①和②，将诱变后的菌悬液涂布在含50mg/L硫代异亮氨酸的基本培养基上，35℃培养48h后，选取菌落较大的菌株。重复步骤④，ILE693的L-异亮氨酸产量最高。⑥培养基种子培养基：葡萄糖25g/L，酵母粉5g/L，(NH4)2SO45g/L，KH2PO42g/L，MnSO40.6g/L，玉米浆40mL，pH6.8-7.2，115℃高压蒸汽灭菌15min。发酵培养基(g/L)：葡萄糖80g/L，(NH4)2SO43g/L，KH2PO41.5g/L，MgSO4·7H2O0.6g/L，MnSO40.015g/L，VB10.001g/L，玉米浆30mL。pH6.8-7.2，115℃高压蒸汽灭菌15min。⑦检测方法将发酵液于8000g离心5min后取上清液，使用0.8％(V/V)2，4-二硝基氟苯对其进行衍生反应，采用高效液相色谱测定L-异亮氨酸含量，其检测条件为：AgilentC18(15mm×4.6mm，5μm)，采用乙腈/醋酸钠二元梯度洗脱，柱温33℃，检测波长360nm，根据高效液相法的测定结果，根据与标准品出峰时间及峰面积对比，确定L-异亮氨酸产量。(2)解除L-异亮氨酸反馈抑制乙酰羟酸合成酶编码基因ilvBNM突变体的获得提取ILE693基因组，利用引物ilvBN-1和ilvBN-2进行PCR扩增，PCR条件为：94℃5min1个循环，94℃30s、56℃30s、72℃1min30个循环，72℃10min1个循环，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种乙酰羟酸合成酶，其特征在于，所述乙酰羟酸合成酶具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种乙酰羟酸合成酶，其特征在于，所述乙酰羟酸合成酶具有SEQIDNO.2所示的氨基酸序列。2.权利要求1所述乙酰羟酸合成酶的编码基因...

【专利技术属性】
技术研发人员：张成林，李英滋，韩世宝，徐庆阳，李燕军，张宇，芦楠，朱福周，董解荣，陈亭利，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：天津,12