活性提高的磷酸转酮酶及在生产代谢物中的应用制造技术

本发明专利技术公开了活性提高的磷酸转酮酶及在生产代谢物中的应用。本发明专利技术提供的蛋白质，为突变体蛋白，为将磷酸转酮酶进行如下任意一种或多种突变得到的蛋白质：第2位由T突变为A；第6位由I突变为T；第14位由N突变为D；(第20位由E突变为D；第120位由T突变为A；第231位由E突变为K；第260位由H突变为Y；第342位由E突变为K；第397位由K突变为R；第676位由D突变为G；第785位由F突变为L；第801位由W突变为R。本发明专利技术还保护突变体蛋白在制备代谢物中的应用。与现有磷酸转酮酶相比，本发明专利技术提供的突变体蛋白的磷酸转酮酶酶活显著增加，进而显著提高目标代谢物的产量。

Phosphotransferase with Enhanced Activity and Its Application in the Production of Metabolites

【技术实现步骤摘要】
活性提高的磷酸转酮酶及在生产代谢物中的应用
本专利技术属于基因工程领域，具体涉及活性提高的磷酸转酮酶，以及该磷酸转酮酶在生产代谢物中的应用，涉及的代谢物包括但不限于氨基酸(特别是源自乙酰辅酶A的氨基酸)、琥珀酸、柠檬酸等。
技术介绍
氨基酸、有机酸，是人类和动物营养中最重要的成分，在医药、健康、食品、化工、动物饲料和化妆品等行业中有着十分重要的地位。当前，氨基酸、有机酸主要采用微生物发酵法来生产，已知的可生产氨基酸的微生物包括埃希氏菌属(Escherichia)，棒杆菌属(Corynebavterium)、短杆菌属(Brevibacterium)等。近年来，随着基因工程技术的发展，利用基因工程手段对菌株进行遗传改造，已经获得了大量的高效的氨基酸、有机酸生产工程菌株。磷酸转酮酶(phosphoketolase，F/XPK)，包括6-磷酸果糖转酮酶(FPK)和5-磷酸木酮糖转酮酶(XPK)。6-磷酸果糖转酮酶催化的反应为：果糖-6-磷酸(F6p)+Pi→乙酰磷酸(AcP)+赤藓糖-4-磷酸(E4P)。5-磷酸木酮糖转酮酶催化的反应为：木酮糖-5-磷酸(X5p)+pi→乙酰磷酸(AcP)+甘油醛-3-磷酸(G3P)。磷酸转酮酶催化的反应能够减少葡萄糖的氧化，但是通常使用的多种基因工程出发菌株(包括大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌等)，都不存在F/XPK，在这些菌株中引入F/XPK，能够增加源自乙酰辅酶A的代谢物的理论转化率。天然的F/XPK酶活性较低，需要大量过表达才能体现出效果，限制了其应用潜力。因此，本领域急需开发酶活性高的磷酸转酮酶。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供活性提高的磷酸转酮酶及在生产代谢物中的应用。本专利技术提供的蛋白质，为突变体蛋白，为将磷酸转酮酶进行如下(a1)至(a12)中任意一种或多种突变得到的蛋白质：(a1)对应于序列3的第2位氨基酸残基由T突变为A；(a2)对应于序列3的第6位氨基酸残基由I突变为T；(a3)对应于序列3的第14位氨基酸残基由N突变为D；(a4)对应于序列3的第20位氨基酸残基由E突变为D；(a5)对应于序列3的第120位氨基酸残基由T突变为A；(a6)对应于序列3的第231位氨基酸残基由E突变为K；(a7)对应于序列3的第260位氨基酸残基由H突变为Y；(a8)对应于序列3的第342位氨基酸残基由E突变为K；(a9)对应于序列3的第397位氨基酸残基由K突变为R；(a10)对应于序列3的第676位氨基酸残基由D突变为G；(a11)对应于序列3的第785位氨基酸残基由F突变为L；(a12)对应于序列3的第801位氨基酸残基由W突变为R。所述多种突变具体可为以上突变中的任意两种、以上突变中的任意三种、以上突变中的任意四种、以上突变中的任意五种突变、以上突变中的任意六种、以上突变中的任意七种、以上突变中的任意八种、以上突变中的任意九种、以上突变中的任意十种、以上突变中的任意十一种或者以上突变的所有。本专利技术提供的突变体蛋白具体可为将磷酸转酮酶进行(a1)和(a2)两种突变得到的蛋白质。本专利技术提供的突变体蛋白具体可为将磷酸转酮酶进行特定突变和非特定突变得到的蛋白质。所述特定突变为(a1)和(a2)两种突变。所述非特定突变为如下突变中的任意一种或任意组合：(a3)、(a4)、(a5)、(a6)、(a7)、(a8)、(a9)、(a10)、(a11)、(a12)。本专利技术提供的突变体蛋白具体可为将磷酸转酮酶进行(a1)和(a2)和(a7)三种突变得到的蛋白质。本专利技术提供的突变体蛋白具体可为将磷酸转酮酶进行特定突变和非特定突变得到的蛋白质。所述特定突变为(a1)和(a2)和(a7)三种突变。所述非特定突变为如下突变中的任意一种或任意组合：(a3)、(a4)、(a5)、(a6)、(a8)、(a9)、(a10)、(a11)、(a12)。所述(a1)具体可为(b1)。所述(a2)具体可为(b2)。所述(a3)具体可为(b3)。所述(a4)具体可为(b4)。所述(a5)具体可为(b5)。所述(a6)具体可为(b6)。所述(a7)具体可为(b7)。所述(a8)具体可为(b8)。所述(a9)具体可为(b9)。所述(a10)具体可为(b10)。所述(a11)具体可为(b11)。所述(a12)具体可为(b12)。(b1)第2位氨基酸残基由T突变为A。(b2)第6位氨基酸残基由I突变为T。(b3)第14位氨基酸残基由N突变为D。(b4)第20位氨基酸残基由E突变为D。(b5)第120位氨基酸残基由T突变为A。(b6)第231位氨基酸残基由E突变为K。(b7)第260位氨基酸残基由H突变为Y。(b8)第342位氨基酸残基由E突变为K。(b9)第397位氨基酸残基由K突变为R。(b10)第676位氨基酸残基由D突变为G。(b11)第785位氨基酸残基由F突变为L。(b12)第801位氨基酸残基由W突变为R。所述磷酸转酮酶具体可为序列表的序列3所示的蛋白质。所述磷酸转酮酶还可为与序列表的序列3所示的蛋白质具有90％，优选95％，更优选98％，最优选99％同源性的蛋白或多肽。示例性的，所述突变体蛋白可为实施例中的M21蛋白、M41蛋白、M71蛋白、M81蛋白、M82蛋白、T2A蛋白、I6T蛋白、N14D蛋白、E20D蛋白、T120A蛋白、E231K蛋白、H260Y蛋白、E342K蛋白、K397R蛋白、D676G蛋白、F785L蛋白、W801R蛋白、T2A/I6T蛋白、T2A/H260Y蛋白、I6T/H260Y蛋白或T2A/I6T/H260Y蛋白。编码以上任一所述突变体蛋白的多核苷酸(例如基因，该基因命名为突变体基因)也属于本专利技术的保护范围。示例性的，所述突变体基因具体可为将磷酸转酮酶基因的编码框进行如下(c1)至(c12)中任意一种或多种突变得到的DNA分子：(c1)第4位核苷酸由A突变为G；(c2)第17位核苷酸由T突变为C；(c3)第40位核苷酸由A突变为G；(c4)第60位核苷酸由A突变为T；(c5)第358位核苷酸由A突变为G；(c6)第691位核苷酸由G突变为A；(c7)第778位核苷酸由C突变T为；(c8)第1024位核苷酸由G突变为A；(c9)第1190位核苷酸由A突变为G；(c10)第2027位核苷酸由A突变为G；(c11)第2353位核苷酸由T突变为C；(c12)第2401位核苷酸由T突变为C。本专利技术提供的突变体基因具体可为将磷酸转酮酶基因的编码框进行(c1)和(c2)两种突变得到的DNA分子。本专利技术提供的突变体基因具体可为将磷酸转酮酶基因的编码框进行特定突变和非特定突变得到的DNA分子。所述特定突变为(c1)和(c2)两种突变。所述非特定突变为如下突变中的任意一种或任意组合：(c3)、(c4)、(c5)、(c6)、(c7)、(c8)、(c9)、(c10)、(c11)、(c12)。本专利技术提供的突变体蛋白具体可为将磷酸转酮酶基因的编码框进行(c1)和(c2)和(c7)三种突变得到的DNA分子。本专利技术提供的突变体蛋白具体可为将磷酸转酮酶基因的编码框进行特定突变和非特定突变得到的DNA分子。所述特定突变为(c1)和(c2)和(c7)三种突变。所述非特定突变为如下突变中的任意一种或任意组合：(c3)、(本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.突变体蛋白，为将磷酸转酮酶进行如下(a1)至(a12)中任意一种或多种突变得到的蛋白质：(a1)对应于序列3的第2位氨基酸残基由T突变为A；(a2)对应于序列3的第6位氨基酸残基由I突变为T；(a3)对应于序列3的第14位氨基酸残基由N突变为D；(a4)对应于序列3的第20位氨基酸残基由E突变为D；(a5)对应于序列3的第120位氨基酸残基由T突变为A；(a6)对应于序列3的第231位氨基酸残基由E突变为K；(a7)对应于序列3的第260位氨基酸残基由H突变为Y；(a8)对应于序列3的第342位氨基酸残基由E突变为K；(a9)对应于序列3的第397位氨基酸残基由K突变为R；(a10)对应于序列3的第676位氨基酸残基由D突变为G；(a11)对应于序列3的第785位氨基酸残基由F突变为L；(a12)对应于序列3的第801位氨基酸残基由W突变为R。

【技术特征摘要】
1.突变体蛋白，为将磷酸转酮酶进行如下(a1)至(a12)中任意一种或多种突变得到的蛋白质：(a1)对应于序列3的第2位氨基酸残基由T突变为A；(a2)对应于序列3的第6位氨基酸残基由I突变为T；(a3)对应于序列3的第14位氨基酸残基由N突变为D；(a4)对应于序列3的第20位氨基酸残基由E突变为D；(a5)对应于序列3的第120位氨基酸残基由T突变为A；(a6)对应于序列3的第231位氨基酸残基由E突变为K；(a7)对应于序列3的第260位氨基酸残基由H突变为Y；(a8)对应于序列3的第342位氨基酸残基由E突变为K；(a9)对应于序列3的第397位氨基酸残基由K突变为R；(a10)对应于序列3的第676位氨基酸残基由D突变为G；(a11)对应于序列3的第785位氨基酸残基由F突变为L；(a12)对应于序列3的第801位氨基酸残基由W突变为R。2.具有权利要求1所述突变体蛋白的融合蛋白。3.编码权利要求1中所述突变体蛋白的多核苷酸或编码权利要求2所述融合蛋白的多核苷酸。4.具有权利要求3所述多核苷酸的表达盒、重组载体、重组微生物或离体的重组细胞。5.特定物质在制备代谢物中的应用；所述特定物质为：权利要求1中所述的突变体蛋白，或，权利要求2中所述融合蛋白，或，权利要求3所述的多核苷酸，或，权利要求4所述表达盒，或，权利要求4所述重组载体，或，权利要求4所述重组微生物，或，权利要求4所述离体的重组细胞。6.一种提高磷酸转酮酶酶活的方法，包括如下步骤：将磷酸转酮酶进行如下(a1)至(a12)中任意一种或多种突变：(a1)对应于序列3的第2位氨基酸残基由T突变为A；(a2)对应于序列3的第6位氨基酸残基由I突变为T；(a3)对应于序列3的第14位氨基酸残基由N突变为D；(a4)对应于序列3的第20位氨基酸残基由E突变为D；(a5)对应于序列3的第120位氨基酸残基由T突变为A；(a6)对应于序列3的第231位氨基酸残基由E突变为K；(a7)对应于序列3的第260...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙际宾，李庆刚，郑平，周文娟，张晓立，德莱奥西班乔·泰沃，马延和，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：天津,12