一种嗜热淀粉分支酶诱导发酵的生产方法技术

本发明专利技术涉及一种嗜热淀粉分支酶诱导发酵的生产方法，该方法包括以下步骤：⑴菌种活化：将购买的三种嗜热脂肪芽胞杆菌冷冻干燥菌粉分别培养，分别得到三种活化的嗜热脂肪芽胞杆菌；⑵菌种保藏：将三种活化的嗜热脂肪芽胞杆菌分别培养，分别得到三种斜面菌种；⑶菌种试管培养：将三种斜面菌种分别培养，分别得到试管种子菌种BTS‑Ⅰ、BTS‑Ⅱ、BTS‑Ⅲ；⑷三角瓶种子培养：将BTS‑Ⅰ、BTS‑Ⅱ、BTS‑Ⅲ试管种子菌种分别培养，分别得到三种摇瓶种子菌种；⑸淀粉分支酶的液体发酵；⑹淀粉分支酶分离制备；⑺淀粉分支酶冻干；⑻淀粉分支酶纯化，即得纯化的淀粉分支酶。本发明专利技术诱导筛选的菌种生长稳定，发酵生产的淀粉分支酶活力高、嗜热性能好，可在高温中保持较高的酶活性。

A Production Method of Thermophilic Amylase Induced Fermentation

【技术实现步骤摘要】
一种嗜热淀粉分支酶诱导发酵的生产方法
本专利技术涉及微生物菌种诱导选育、酶制剂发酵生产和淀粉改性领域，尤其涉及一种嗜热淀粉分支酶诱导发酵的生产方法。
技术介绍
在自然界中淀粉主要以直链淀粉和支链淀粉两种形式贮藏多糖。直链淀粉是通过α-1,4-D-葡萄糖苷键连接而成的线性长链分子，其中有少量α-1,6糖苷键（areview[J].JFoodSci,2017），而支链淀粉在直链淀粉链上以α-1,6-糖苷键链接为分支，其分支点位置、分支度丰富（[J].CritRevFoodSciNutr,1995,35(5):373-403.）。淀粉分支酶(Starchbranchingenzyme;EC2.4.1.18)是一类糖基转移酶，属于糖苷水解酶家族13(GH13)（[J].CarbohydrRes,1993,250(1):R7-R20；ApplMicrobiolBiotechnol,2001,57(5-6):653-659）。淀粉分支酶能催化淀粉分子中α-1,4-糖苷键的断裂，在原主链上形成新的α-1,6-分支点。淀粉分支酶广泛分布于动物、植物、微生物中，它可以通过酶催化反应对淀粉中的α-糖苷键进行断裂后重新链接而改变淀粉的结构，所以在生物改性淀粉的制备中是重要的催化剂之一。淀粉的工业化应用中常出现淀粉溶解度低、易回生、高粘度等现象，制约其使用领域。因此，通过合理的方法对淀粉的结构组成进行改造制备改性淀粉，能增加淀粉的应用范围，提高淀粉利用效率。使用物理或化学改性手段获得的改性淀粉改善了淀粉应用性能，虽已推广应用并产生了较高的经济价值，但产品中一般存在化学试剂残留、生成副产物多等问题，对环境造成不利影响（王旭青，[D].物理化学方法改性淀粉在造纸中的应用,江南大学硕士论文,2015；张宝军，[D].淀粉复合物的制备及其在纸张阻隔涂布中的应用，华南理工大学硕±学位论文，2016）。生物酶法制备改性淀粉因底物选择性高、产物特强异性、反应条件温和且工艺绿色环保，逐步受到重视。赵方等以α-淀粉酶改性木薯淀粉制备了阳离子酶改性淀粉乳胶液应用于瓦楞纸表面施胶剂（赵方等，酶改性淀粉接枝物的制备及性能[J].造纸化学品,2012,31(7):49-52.）；张映桤等将未经氧化的原玉米淀粉使用α-淀粉酶酶改性，制成表面施胶液用于文化纸表面施胶（张映桤等，酶改性淀粉在文化纸中的应用，[J].造纸化学品，2008，20（3）：38-40）。其它相关研究还有利用α-中温淀粉酶制备改性淀粉施胶液对牛皮挂面纸进行表面施胶（徐梦蝶，[D].交联淀粉牛皮挂面纸互穿网络增强及机理研究，南京林业大学硕士论文,2015）；4-α-葡萄糖基转移酶、分支酶对淀粉的改性作用等（姜欢，[D].4-α-葡萄糖基转移酶、分支酶对淀粉的改性作用研究）等。淀粉分支酶广泛存在于生物体内，由于来源差异，其催化活性与底物的链长、空间位置、种类均有关系。在工业应用中，与动植物来源的酶相比，微生物来源的分支酶有诸多优势：菌种来源广泛、易于选育和培养、生产工艺简单、产量不受资源影响、副产物少、对环境影响小。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种活力高、嗜热性能好的嗜热淀粉分支酶诱导发酵的生产方法。为解决上述问题，本专利技术所述的一种嗜热淀粉分支酶诱导发酵的生产方法，包括以下步骤：⑴菌种活化：将购买的嗜热脂肪芽胞杆菌Ⅰ、嗜热脂肪芽胞杆菌Ⅱ、嗜热脂肪芽胞杆菌Ⅲ冷冻干燥菌粉按20mg~50mg/8~10mL分别接种于牛肉浸膏液体培养基中，三种菌分别于45℃、50℃、55℃恒温摇床中，以150r/min的转速培养72h，分别得到活化的嗜热脂肪芽胞杆菌Ⅰ、活化的嗜热脂肪芽胞杆菌Ⅱ、活化的嗜热脂肪芽胞杆菌Ⅲ；⑵菌种保藏：将所述活化的嗜热脂肪芽胞杆菌Ⅰ、活化的嗜热脂肪芽胞杆菌Ⅱ、活化的嗜热脂肪芽胞杆菌Ⅲ使用接种环按0.1~0.2mL/8~10mL分别接种于牛肉浸膏琼脂糖培养基中，分别于45℃、50℃、55℃恒温培养72h，当菌落均匀长满斜面后，于冰箱0℃~4℃过夜后，再于-18℃冷冻保藏，分别得到三种嗜热脂肪芽胞杆菌保藏的斜面菌种；⑶菌种试管培养：将所述三种嗜热脂肪芽胞杆菌保藏的斜面菌种使用接种环按2~3环/8~10mL分别接种于种子试管培养基中，分别于45℃、50℃、55℃恒温培养72h，分别得到三种试管种子菌种，于0℃~4℃保藏备用；其中：嗜热脂肪芽胞杆菌Ⅰ选育分离后的菌种编号为BTS-Ⅰ、嗜热脂肪芽胞杆菌Ⅱ选育分离后的菌种编号为BTS-Ⅱ、嗜热脂肪芽胞杆菌Ⅲ选育分离后的菌种编号为BTS-Ⅲ；⑷三角瓶种子培养：将所述BTS-Ⅰ试管种子菌种、BTS-Ⅱ试管种子菌种、BTS-Ⅲ试管种子菌种按5%~10%的接种比例分别接种于摇瓶发酵培养基中，在摇床为转速150r/min的条件下分别于45℃、50℃、55℃恒温培养72h，分别得到BTS-Ⅰ摇瓶种子菌种、BTS-Ⅱ摇瓶种子菌种、BTS-Ⅲ摇瓶种子菌种，于0℃~4℃保藏备用；⑸淀粉分支酶的液体发酵：在5L发酵罐中装入4L发酵培养基，121℃灭菌20min，冷却至45℃；然后将所述BTS-Ⅰ摇瓶种子菌种或所述BTS-Ⅱ摇瓶种子菌种或所述BTS-Ⅲ摇瓶种子菌种按5%~10%的接种比例接种于装有4L发酵培养基容量为5L的发酵罐中发酵培养，得到发酵种子菌种；在100L发酵罐中装入60L发酵培养基，121℃灭菌20min，冷却至45℃；将所述发酵种子菌种按5%~10%的接种比例接种其中进行扩大培养，即得淀粉分支酶发酵液；⑹淀粉分支酶分离制备：所述淀粉分支酶发酵液经膜浓缩后离心，得浓缩分支酶；⑺淀粉分支酶冻干：所述浓缩分支酶经冷冻干燥、粉粹、过60目筛，即得冻干分支酶产品；⑻淀粉分支酶纯化：所述浓缩分支酶样品经硫酸铵盐析、柱层析分离，即得纯化的淀粉分支酶。所述步骤⑴中嗜热脂肪芽胞杆菌Ⅰ的微生物编号为CGMCC1.1865；嗜热脂肪芽胞杆菌Ⅱ的微生物编号为CGMCC1.1923；嗜热脂肪芽胞杆菌Ⅲ的生物编号为ACTT7953。所述步骤⑴中牛肉浸膏液体培养基是指将1kg剔除肉筋和脂肪后的新鲜牛肉绞成肉泥，加入2.5L去离子水，0~4℃冷浸12h，煮沸2h，冷却后3层纱布过滤，0.1mol/LNaOH溶液调pH值至7.0~7.5，10μm膜压滤去除沉淀，上清补水至2.5L；然后分装至25mL的试管或250mL三角瓶中，其中试管每管8~10mL，三角瓶每瓶150mL；封装后无菌膜封口，121℃灭菌20min后冷却即得。所述步骤⑵中牛肉浸膏琼脂糖培养基是指将1kg剔除肉筋和脂肪后的新鲜牛肉绞成肉泥，加入2.5L去离子水，0~4℃冷浸12h，煮沸2h，冷却后3层纱布过滤，0.1mol/LNaOH溶液调pH值至7.0~7.5，10μm膜压滤去除沉淀，上清补水至2.5L，再加入1.5%的琼脂糖，加热融化后分装至25mL的试管或φ8cm的培养皿中，其中试管每管8~10mL，培养皿每个15~20mL，试管无菌膜封口，培养皿加盖后121℃灭菌20min，趁热放于无菌工作台，试管保持斜角10~15度，培养皿水平放置，冷却凝固后即得。所述步骤⑶中种子试管培养基是指按质量百分比计依次将葡萄糖0.05%、酵母膏0.1%、大豆蛋白胨0.2%、NaCl0.1%、余量为去离子水混合本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种嗜热淀粉分支酶诱导发酵的生产方法，包括以下步骤：⑴菌种活化：将购买的嗜热脂肪芽胞杆菌Ⅰ、嗜热脂肪芽胞杆菌Ⅱ、嗜热脂肪芽胞杆菌Ⅲ冷冻干燥菌粉按20mg~50 mg/8~10mL分别接种于牛肉浸膏液体培养基中，三种菌分别于45 ℃、50 ℃、55 ℃恒温摇床中，以150 r/min的转速培养72 h，分别得到活化的嗜热脂肪芽胞杆菌Ⅰ、活化的嗜热脂肪芽胞杆菌Ⅱ、活化的嗜热脂肪芽胞杆菌Ⅲ；⑵菌种保藏：将所述活化的嗜热脂肪芽胞杆菌Ⅰ、活化的嗜热脂肪芽胞杆菌Ⅱ、活化的嗜热脂肪芽胞杆菌Ⅲ使用接种环按0.1~0.2mL/8~10mL分别接种于牛肉浸膏琼脂糖培养基中，分别于45 ℃、50 ℃、55 ℃恒温培养72 h，当菌落均匀长满斜面后，于冰箱0℃~4℃过夜后，再于‑18℃冷冻保藏，分别得到三种嗜热脂肪芽胞杆菌保藏的斜面菌种；⑶菌种试管培养：将所述三种嗜热脂肪芽胞杆菌保藏的斜面菌种使用接种环按2~3环/8~10mL分别接种于种子试管培养基中，分别于45 ℃、50 ℃、55 ℃恒温培养72 h，分别得到三种试管种子菌种，于0 ℃~4℃保藏备用；其中：嗜热脂肪芽胞杆菌Ⅰ选育分离后的菌种编号为BTS‑Ⅰ、嗜热脂肪芽胞杆菌Ⅱ选育分离后的菌种编号为BTS‑Ⅱ、嗜热脂肪芽胞杆菌Ⅲ选育分离后的菌种编号为BTS‑Ⅲ；⑷三角瓶种子培养：将所述BTS‑Ⅰ试管种子菌种、BTS‑Ⅱ试管种子菌种、BTS‑Ⅲ试管种子菌种按5%~10%的接种比例分别接种于摇瓶发酵培养基中，在摇床为转速150 r/min的条件下分别于45℃、50℃、55℃恒温培养72 h，分别得到BTS‑Ⅰ摇瓶种子菌种、BTS‑Ⅱ摇瓶种子菌种、BTS‑Ⅲ摇瓶种子菌种，于0 ℃~4℃保藏备用；⑸淀粉分支酶的液体发酵：在5L发酵罐中装入4L发酵培养基，121℃灭菌20min，冷却至45℃；然后将所述BTS‑Ⅰ摇瓶种子菌种或所述BTS‑Ⅱ摇瓶种子菌种或所述BTS‑Ⅲ摇瓶种子菌种按5%~10%的接种比例接种于装有4L发酵培养基容量为5L的发酵罐中发酵培养，得到发酵种子菌种；在100L发酵罐中装入60L发酵培养基，121℃灭菌20min，冷却至45℃；将所述发酵种子菌种按5%~10%的接种比例接种其中进行扩大培养，即得淀粉分支酶发酵液；⑹淀粉分支酶分离制备：所述淀粉分支酶发酵液经膜浓缩后离心，得浓缩分支酶；⑺淀粉分支酶冻干：所述浓缩分支酶经冷冻干燥、粉粹、过60目筛，即得冻干分支酶产品；⑻淀粉分支酶纯化：所述浓缩分支酶样品经硫酸铵盐析、柱层析分离，即得纯化的淀粉分支酶。...

【技术特征摘要】
1.一种嗜热淀粉分支酶诱导发酵的生产方法，包括以下步骤：⑴菌种活化：将购买的嗜热脂肪芽胞杆菌Ⅰ、嗜热脂肪芽胞杆菌Ⅱ、嗜热脂肪芽胞杆菌Ⅲ冷冻干燥菌粉按20mg~50mg/8~10mL分别接种于牛肉浸膏液体培养基中，三种菌分别于45℃、50℃、55℃恒温摇床中，以150r/min的转速培养72h，分别得到活化的嗜热脂肪芽胞杆菌Ⅰ、活化的嗜热脂肪芽胞杆菌Ⅱ、活化的嗜热脂肪芽胞杆菌Ⅲ；⑵菌种保藏：将所述活化的嗜热脂肪芽胞杆菌Ⅰ、活化的嗜热脂肪芽胞杆菌Ⅱ、活化的嗜热脂肪芽胞杆菌Ⅲ使用接种环按0.1~0.2mL/8~10mL分别接种于牛肉浸膏琼脂糖培养基中，分别于45℃、50℃、55℃恒温培养72h，当菌落均匀长满斜面后，于冰箱0℃~4℃过夜后，再于-18℃冷冻保藏，分别得到三种嗜热脂肪芽胞杆菌保藏的斜面菌种；⑶菌种试管培养：将所述三种嗜热脂肪芽胞杆菌保藏的斜面菌种使用接种环按2~3环/8~10mL分别接种于种子试管培养基中，分别于45℃、50℃、55℃恒温培养72h，分别得到三种试管种子菌种，于0℃~4℃保藏备用；其中：嗜热脂肪芽胞杆菌Ⅰ选育分离后的菌种编号为BTS-Ⅰ、嗜热脂肪芽胞杆菌Ⅱ选育分离后的菌种编号为BTS-Ⅱ、嗜热脂肪芽胞杆菌Ⅲ选育分离后的菌种编号为BTS-Ⅲ；⑷三角瓶种子培养：将所述BTS-Ⅰ试管种子菌种、BTS-Ⅱ试管种子菌种、BTS-Ⅲ试管种子菌种按5%~10%的接种比例分别接种于摇瓶发酵培养基中，在摇床为转速150r/min的条件下分别于45℃、50℃、55℃恒温培养72h，分别得到BTS-Ⅰ摇瓶种子菌种、BTS-Ⅱ摇瓶种子菌种、BTS-Ⅲ摇瓶种子菌种，于0℃~4℃保藏备用；⑸淀粉分支酶的液体发酵：在5L发酵罐中装入4L发酵培养基，121℃灭菌20min，冷却至45℃；然后将所述BTS-Ⅰ摇瓶种子菌种或所述BTS-Ⅱ摇瓶种子菌种或所述BTS-Ⅲ摇瓶种子菌种按5%~10%的接种比例接种于装有4L发酵培养基容量为5L的发酵罐中发酵培养，得到发酵种子菌种；在100L发酵罐中装入60L发酵培养基，121℃灭菌20min，冷却至45℃；将所述发酵种子菌种按5%~10%的接种比例接种其中进行扩大培养，即得淀粉分支酶发酵液；⑹淀粉分支酶分离制备：所述淀粉分支酶发酵液经膜浓缩后离心，得浓缩分支酶；⑺淀粉分支酶冻干：所述浓缩分支酶经冷冻干燥、粉粹、过60目筛，即得冻干分支酶产品；⑻淀粉分支酶纯化：所述浓缩分支酶样品经硫酸铵盐析、柱层析分离，即得纯化的淀粉分支酶。2.如权利要求1所述的一种嗜热淀粉分支酶诱导发酵的生产方法，其特征在于：所述步骤⑴中嗜热脂肪芽胞杆菌Ⅰ的微生物编号为CGMCC1.1865；嗜热脂肪芽胞杆菌Ⅱ的微生物编号为CGMCC1.1923；嗜热脂肪芽胞杆菌Ⅲ的生物编号为ACTT7953。3.如权利要求1所述的一种嗜热淀粉分支酶诱导发酵的生产方法，其特征在于：所述步骤⑴中牛肉浸膏液体培养基是指将1kg剔除肉筋和脂肪...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡先望，张鸣明，李素岳，何海宁，洪霞，郭立群，梁宁，广忠勇，张春园，
申请(专利权)人：甘肃省商业科技研究所有限公司，
类型：发明
国别省市：甘肃,62