本发明专利技术公开了一种培育直链淀粉含量提高的玉米的方法。本发明专利技术所提供的培育直链淀粉含量提高的玉米的方法，是将表达如下干扰ＲＮＡ分子的重组载体导入玉米中，得到淀粉分支酶ＳＢＥＩＩｂ编码基因被沉默的玉米即为直链淀粉含量提高的玉米；所述干扰ＲＮＡ分子的一条链序列如序列表中序列１所示，另一条链序列如序列表中序列２所示。实验结果表明，通过本发明专利技术方法能使玉米中直链淀粉的含量提高１５％。另外，本发明专利技术方法能够克服传统育种方法的局限，通过基因工程技术快速获得目标性状，再与常规育种结合，进而加快了高直链玉米淀粉的生产品种培育。
Method for cultivating maize with amylose content by using RNA interference technique
The invention discloses a method for cultivating corn with improved amylose content. The invention provides a method to improve the cultivation of the amylose content of maize, is the expression of recombinant vector into maize following interference RNA molecule, SBEIIb gene encoding starch branching enzyme obtained was silent for Improving Maize amylose content of maize; the interference of RNA molecular chain sequence sequence in the sequence table 1 shows, another 2 chain sequence as shown in sequence in a sequence table. The experimental results show that the method of the invention can make the content of corn amylose increased 15%. In addition, the method of the invention can overcome the limitations of traditional breeding methods, through rapid target character gene engineering technology, combined with conventional breeding, thus speeding up the high amylose corn starch production breeding.
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种培育直链淀粉含量提高的玉米的方法，特别涉及一种利用RNA 干扰技术培育直链淀粉含量提高的玉米的方法。
技术介绍
玉米产业发展对我国农业经济具有重要的战略意义。开发高直链玉米可延伸玉 米的精深加工产业链，对提高玉米种植的附加值和农民增产、增收具有深远的意义； 同时也为新型可降解环保材料的开发、应用和推广有积极的促进作用。玉米中淀粉约占普通玉米籽粒干重的70%-75%，其中支链淀粉约占总淀粉含量 的75%左右，而直链淀粉仅占25%左右。随着淀粉工业的迅速发展，直链淀粉被广 泛地应用到各个领域(王凤格等，2002)。尤其在塑料行业，高直链淀粉使塑料制品 具有生物降解性，是塑料工业的更新原料，是解决目前严重的"白色污染"的有效 途径，应用前景十分广阔。直链淀粉属于抗消化淀粉，可用于制作糖尿病、肥胖、 高血压、胆结石等病人的保健食品(王振华等，2002;张文青，2005;张志英和沈 建福，2005)。从普通玉米淀粉中提取直链淀粉成本很高。目前我国的特用玉米资源中，尚无 育成的高直链淀粉玉米品种在生产上推广，工业上需要的直链淀粉大部分从美国进 口，每吨2000 2500美元，价格为普通淀粉的10倍，少部分由普通玉米淀粉加工 提取而成(张瑛等，2005)。因此，开发出高直链淀粉含量的玉米品种十分必要。长期以来，广大科研工作者利用常规杂交技术在玉米新品种选育和品质改良方 面做了大量的工作，培育出了一批具有较好应用前景的自交系。但是，常规杂交育 种技术在玉米品质改良的过程中也暴露出了诸多缺点。玉米中淀粉的合成过程受到一系列酶的调控。淀粉分支酶(starch branching enzymes, SBE)是淀粉生物合成过程中的一个关键酶，它能切开a—l， 4一糖苷键连 接的寡糖片断，又能把切下的短链通过a—1，6 —糖苷键连接于受体链上，形成分 支结构(Visser and Jacobsen, 1993;Smith a丄，1997)。玉米淀粉分支酶有3 种同工酶，SBEI、 SBEIIa和SBEIIb。 SBEI、 SBEIIb主要在胚乳中存在，SBEIIa主要 存在于叶片中(Guan H P， " ， 1994)。目前，对淀粉分支酶基因已从分子生物学水平和生物化学方面进行了一定的研究，对淀粉分支酶的生理功能基本清楚(Blauth et s丄，2001; Blauth et s义，2002; G羅"s丄，1994; ELbashir et a丄，2001)。RNA干扰(RNA interference, RNAi)技术是近年来兴起的基因表达调控技术。它作为一种新的技术方法，已经在各个不同的生物研究领域内广泛应用并取得了很多 重要成果(ELbashir et a7， 2001; Ogita et a7. ， 2003， Ogita et ，2004;Liu et a丄，2002)，因此RNAi被人们认为是后基因组时代进行大规模基因功能验证及表达 调控分析，以及遗传改良的最佳方法之一。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种培育直链淀粉含量提高的玉米的方法。 本专利技术所提供的培育直链淀粉含量提高的玉米的方法，是将表达如下干扰RNA 分子的重组载体导入玉米中，得到淀粉分支酶SBEIIb编码基因被沉默的玉米即为 直链淀粉含量提高的玉米;所述干扰RNA分子的一条链序列如序列表中序列1所示， 另一条链序列如序列表中序列2所示。 所述重组载体的结构如图1所示。本专利技术方法通过在玉米自交系中表达^^//》基因的RNAi分子，沉默玉米淀粉 分支酶基因^6//6的表达，降低支链淀粉合成量，从而提高直链淀粉含量。实验 结果表明，通过本专利技术方法能使玉米中直链淀粉的含量提高15%。另外，本专利技术方 法能够克服传统育种方法的局限，通过基因工程技术快速获得目标性状，再与常规 育种结合，进而加快了高直链玉米淀粉的生产品种培育。 附图说明图1为RNAi重组表达载体pBAC413的结构示意图。 图2为玉米愈伤组织诱导、植株分化与移栽的图。 图3为i/Lra/2的DNA点杂交结果。 图4为/^ZZ^ i/ z^ro/2的PCR检测结果。 图5为i/ z^TOT的PCR—Southern检测结果。 具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明均为常规方法。 实施例1、通过向玉米中导入^&//6基因的RNAi载体从而提高玉米中直链淀 粉含量玉米自交系178、 478、 501、黄C和ZP501K为通用自交系材料，来源于国家种质资源库。限制性内切酶、T4DNA连接酶购自NEB公司(英国)，pGEM-T easy载体购自 Promega公司(美国)，Tag DNA聚合酶购自TaKaRa公司(日本)，大肠杆菌(￡ coA') 菌株DH5a购于北京天根公司。一、We//6基因的RNAi载体pBAC413的构建1、 淀粉分支酶基因sbellb的克隆在网络数据库(http: //jura. wi. mit. edu / bioc / siRNAext / )中输入sbe lib 的mRNA序列(AF072725)后，得到一系列siRNA最佳作用位点，利用DNAMAN进行Not I、 HindIII、 EcoR I、 BaraHI等常用酶切位点的分析。依上述步骤选定sbellb mRNA序 列的899-2039共1162bp为目标序列(包含3个最佳siRNA位点区段1458-1480、 1625-1647、 1934-1956)，设计一对引物，Pl(5' GATCCTCCTGAAGAGGTAAAG 3')和 P2(5' GAATAAACTTACCACTTGGAAG 3')。以玉米基因组DNA为模板，进行PCR扩增。 25叱PCR反应体系为10XPCR buffer 2. 5ML ， dNTP(2. 5 mmol / L)2. 0叱，Pl、 P2(10 Pm /叱)各l. OHL，基因组DNA 1. 0叱，TaKaRa Taq(5 U / PL )0. 5叱，以(1甜20 补足到25叱。PCR扩增条件为94。C变性3 min, 50。C延伸1 min， 72°C退火2 min; 94°C变性45S， 50. 9。C延伸50S， 72。C退火90 S，循环35次；最后72。C延伸10 min。 PC財广增得到1 162 bp sbell b基因片段。将扩增产物与pGEM—T easy vector连接。 PCR阳性克隆(命名为pTsbenb)经限制性内切酶酶切初步确认后进行全序列测序， 结果表明重组载体结构正确。2、 sbellb启动子的克隆依据玉米sbelIb启动子序列(AF072725)设计l对引物，上游引物(P3)引入酶 切位点HindIII，下游引物(P4)引入酶切位点BamH I和Xma I。 P3: 5， -AAGCTT ATTTTTGATAATTCATCGGACCG -3' ， P4: 5' -GGATCCCGGGCCTTCGCAGCCGGATCGGATCG-3，(划 线部分为酶切位点)。以玉米基因组丽A为模板，扩增得到3kb产物，将产物与pGEM— T easy vector连接。阳性克隆(命名为pTsbelib P本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种培育直链淀粉含量提高的玉米的方法，是将表达如下干扰ＲＮＡ分子的重组载体导入玉米中，得到淀粉分支酶ＳＢＥⅡｂ编码基因被沉默的玉米即为直链淀粉含量提高的玉米；所述干扰ＲＮＡ分子的一条链序列如序列表中序列１所示，另一条链序列如序列表中序列２所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张晓东，陈绪清，杨凤萍，张立全，梁荣奇，郭新梅，
申请(专利权)人：北京市农林科学院，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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