用RNA干涉提高水稻直链淀粉含量的方法技术

本发明专利技术公开了一种生物技术领域的利用ＲＮＡ干涉提高水稻中直链淀粉的含量的方法。本发明专利技术从水稻中克隆淀粉分支酶ＲＢＥ３基因片段作为ＲＮＡ干扰片段，以胚乳特异性启动子启动表达，构建了ＲＢＥ３基因的ｓｉＲＮＡ表达载体，利用农杆菌介导的方法，获得了干涉ＲＢＥ３基因的转基因水稻。ＲＴ－ＰＣＲ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交检验目的基因的整合和表达情况，对转基因水稻植株胚乳直链淀粉含量碘显色法测定表明，转基因植株直链淀粉含量较非转基因株平均提高幅度为１４０％，最高达到２３８％，筛选后获得籽粒直链淀粉含量显著提高的转基因水稻植株。从而提供了一种提高水稻中直链淀粉含量的方法，为利用转基因水稻大规模生产直链淀粉奠定了基础。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种生物
的提高水稻种子中直链淀粉含量的方法，尤其涉及一种用RNA干涉提高水稻种子中直链淀粉含量的方法。
技术介绍
淀粉是高等植物中碳水化合物的主要贮藏形式，也是粮食作物产品的最主要成分。植物的贮藏淀粉主要包含两种成分直链淀粉和支链淀粉。直链淀粉和支链淀粉的比例决定着淀粉的用途，支链淀粉主要用于食品业，而直链淀粉在工业上有着广泛的用途，涉及食品、医疗、纺织、造纸、环保等30多个领域。直链淀粉，尤其是经过理化修饰后的直链淀粉功能进 一步加强，如将直链淀粉进行溶解，与氢键结合，可形成刚性不透明胶体，这一特性用于糖 果业，可以使糖果保持固定的形状和完整的造型；直链淀粉还用于食品业的增厚剂、固定剂、 炸薯条中阻止过度吸油分的包衣剂；利用直链淀粉取代聚苯乙烯生产可降解塑料，这种塑料 具有大量应用于包装工业、农用薄膜加工业和从根本上解决白色污染问题的潜能。植物淀粉的合成是淀粉合成酶经由一系列复杂的过程产生的。目前认为淀粉的生物合成 主要涉及四类酶——ADPG焦磷酸化酶、淀粉合成酶、淀粉分支酶和去分支酶。它们分别催化 ADP-葡萄糖的形成、葡聚糖链的延伸以及分支链的形成。直链淀粉是由颗粒结合型淀粉合成 酶I (granule-bound starch synthase I, GBSSI或WAXY)直接催化的；而支链淀粉则是 淀粉分支酶(starch branching enzyme, SBE)、可溶性淀粉合成酶(soluble starch synthase, SSS)和淀粉去分支酶(debranching enzyme, DBE)共同作用的产物，其中SBE的一个同工 型RBE3被认为在形成支链淀粉过程中起到最关键的作用。因此，利用基囟工程手段改良淀粉 品质的策略集中在调节淀粉合成过程中特定酶的含量或是几种酶之间的协调关系上。在禾谷类作物研究上，获得高水平的直链淀粉同时并不明显减少淀粉总含量的突破是 1952年Vineyard和Bear发现了位于玉米第5条染色体上的ae (amylose extender)基因。 遗传研究表明高直链淀粉主要是由ae基因控制的，ae基因及其修饰基因的协同作用可使玉 米淀粉中直链淀粉的含量提高到50-80%。位于第五连锁群上的ae基因目前己被SSR连锁标 记，已从高淀粉玉米中克隆了 ae基因，该基因共有23449bp,其在Genebank中的接受号为AF072725。这些为该性状的转移和利用提供了重要的种质资源和基因资源，但由于该基因较 大，不易操作，同时该基因表达伴随其它农艺性状变劣、籽粒产量低，应用受到限制。另外， 由于高直链淀粉的遗传十分复杂，采用常规杂交、回交转育和轮回选择等育种方法，所需群 体要足够大，且周期长、分析样品多，因此投入也较多。基因工程改变淀粉质量集中于GBSS， SSS和SBE三种酶的操作上，主要使用技术-.1、 正义和反义RNA转基因技术，即是通过导入某个酶基因的正义结构或反义结构，影响 细胞内酶的含量或活性，引起目的基因的过量表达或使其表达受抑制，从而达到对淀粉结构 的控制。Visser等人(1991)利用反义RNA技术，向马铃薯中导入反向连接的GBSS基因， 导致GBSS基因含量和活性下降，进而导致马铃薯块茎中直链淀粉含量锐减(减少70鬼一100W。 同样地利用反义RNA技术，在木薯(Salehuzzman, 1993)、水稻等植物中，也获得了低(或无) 直链淀粉的转化体。国际专利W09722703A2报道了应用反义RNA技术将玉米sbe2b基因的全 长cDNA转化玉米的研究，结果获得了籽粒淀粉中直链淀粉含量较高的转基因玉米。然而反义 技术的应用存在一定的局限性，其对内源性基因表达的抑制较弱，往往产生过渡性的表型， 会妨碍对目的基因功能的准确判断。其抑制效应遗传稳定性较差，不能稳定可靠地降低目的 基因的表达。2、 基因敲除技术和DNA/RNA嵌合分子介导的基因转变技术，但该方法一次只能研究一个 基因，不能有效地对多基因家族进行敲除。 一些在动植物发育过程中有关键作用的基因，如 果在DNA水平采用基因敲除或突变进行可遗传的修饰，则会过早地基因沉默，产生致死表型， 因而无法深入研究。
技术实现思路
本专利技术所解决的技术问题是提供一种客服目前常规育种过程中难以提高水稻籽粒直链淀 粉的含量，通过采用RNA干涉的方法提高水稻直链淀粉的含量，使其用RNA千涉方法抑制水 稻淀粉合成关键酶5^fllb基因在种子胚乳中的表达，从而提高水稻种子中直链淀粉含量的方 法。本专利技术是通过以下技术方案实现的 一种用RNA干涉提高水稻直链淀粉含量的方法，从 水稻中克隆^SM基因片段作为RNA干扰片段，以胚乳特异性启动子启动表达，构建含y^^ 基因正反片段的表达载体，用根癌农杆菌介导，将vKffi^基因的正反结构转入水稻中，RT-PCR 和Southern杂交检验目的基因的整合和表达情况，对转基因水稻植株胚乳直链淀粉含量采用 碘显色法测定，筛选后获得籽粒直链淀粉含量显著提高的转基因水稻植株。具体包括以下主要步骤(1) 根据水稻淀粉合成关键酶RBE3基因的序列，通过序列比对，确定水稻直链淀粉酶 基因的特异性RNA干涉序列，根据干涉序列设计引物，进行水稻淀粉合成关键酶RBE3基因的 千涉片段的特异性扩增；(2) 以胚乳特异性启动子启动表达，构建含RBE3基因正反片段的植物表达载体；(3) 转化含有目的干涉片段的载体，并将目的干涉片段整合到水稻基因组中；(4) 通过RT-PCR和Southern杂交等分子检测方法鉴定转基因水稻；(5) 利用碘显色法检测籽粒直链淀粉含量，筛选获得直链淀粉含量提高的转基因水稻。 在所述步骤(1)中，通过同源性搜索和序列比对，确定该RNA干涉特异片段位于水稻基因组的66197 66391位置，长195bp，包含RBE3基因的第12个外显子(135bp)序列，并 有60bp的内含子序列。在所述步骤(2)中，以高分子量麦谷蛋白(HMW)启动子作为胚乳特异性启动子，把RBE3 基因正反片段置于特异启动子之后，特异性的在胚乳里抑制RBE3基因的表达。在所述步骤(4)中，所述的分子检测分别为以筛选标记bar基因的特异性引物的PCR扩 增片段作探针，采用Southern杂交准确验证目的干涉片段整合到水稻基因组中及其拷贝数； 和设计RBE3基因的RT-PCR专用引物和水稻actin基因的特异引物，然后转基因水稻和对照 分别进行RT-PCR，采用半定量PCR分析RBE3基因的表达差异。与已有技术相比，本专利技术的有益效果体现在1、 本专利技术是利用RNA干涉技术进行水稻淀粉品质改良。这是RNA干涉技术首次在该领域 进行研究与运用，也是本专利技术的独创之处。RNA干涉技术具有高效性、特异性、可遗传性、 操作简单等特点，这是传统的基因敲除技术和反义RNA技术所无法比拟的。2、 在受体选择上，传统的基因敲除技术和反义RNA技术所要研究的受体一般是完整的基 因序列，对于基因序列不明确的受体，具有明显的局限性。而利用RNA干涉技术，只需要知 道与受体同源的基因片段，就可对受体进行研究，因此，研究范围较为广泛。3、 在操作方法上，反义RNA技术一般要构建的是含数千个碱基对的大片本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用ＲＮＡ干涉提高水稻直链淀粉含量的方法，其特征在于：从水稻中克隆ＲＢＥ３基因片段作为ＲＮＡ干扰片段，以胚乳特异性启动子启动表达，构建含ＲＢＥ３基因正反片段的表达载体，用根癌农杆菌介导，将ＲＢＥ３基因的正反结构转入水稻中，ＲＴ－ＰＣＲ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交检验目的基因的整合和表达情况，对转基因水稻植株胚乳直链淀粉含量采用碘显色法测定，筛选后获得籽粒直链淀粉含量显著提高的转基因水稻植株。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：程备久，张建，江海洋，夏眠，朱苏文，汪洁明，
申请(专利权)人：安徽农业大学，
类型：发明
国别省市：34[中国|安徽]