马铃薯淀粉分支酶Ⅱ制造技术

一种淀粉分支酶Ⅱ（ＳＢＥ Ⅱ）的氨基酸序列，所说的氨基酸序列包含ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１所示的氨基酸序列。（*该技术在2016年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种新型马铃薯淀粉分支酶。更具体地说，本专利技术涉及马铃薯的第二种淀粉分支酶(SBE II)的氨基酸序列和它的片段以及它们相应的DNA序列。并且，本专利技术涉及含有这种DNA序列的载体、产生转基因马铃薯的方法和所说的马铃薯在产生淀粉方面的用途。淀粉是一种不同分子形式的复杂混合物，所说的分子在葡萄糖链的聚合和分支程度上不同。淀粉由直链淀粉和支链淀粉组成，其中直链淀粉由本质上线型的α-1，4-葡聚糖组成，支链淀粉由彼此通过α-1，6-键连接的α-1，4-葡聚糖组成，这样，形成了分支的多葡聚糖。因此，淀粉不是均一的原材料。淀粉是通过至少三种酶促反应合成的，其中涉及到ADP葡萄糖磷酸化酶(EC 2.7.7.27)、淀粉合成酶(EC 2.4.1.21)和淀粉分支酶(EC 2.4.1.18)。淀粉分支酶(SBE，也称为Q-酶)具有两种不同的酶促活性。它催化α-1，4-糖苷键的水解以及在淀粉的分支成分合成期间形成α-1，6-糖苷键，即支链淀粉。植物淀粉是一种有价值的可再生原材料的来源，例如用于化学工业(Visser和Jacobsen，1993)。然而，淀粉的质量必须满足加工工业的要求，其中，结构的均一性是一项重要的指标。为了便于在工业上应用，要求植物分别只含有直链淀粉和支链淀粉。已经提出了改变淀粉中直链淀粉/支链淀粉比例的方法。例如，WO95/04826中描述了编码脱支酶的DNA序列，此酶能够减少或者增加转基因植物(如马铃薯)中的支链淀粉的分支程度。在WO92/14827中描述了包含DNA序列的质粒，所说的DNA序列在插入到植物的基因组中后，能够使再生的植株的碳水化合物浓度和碳水化合物的组成发生变化。这些变化是由于位于这些质粒中的分支酶序列引起的。这种分支酶可用来改变植物(特别是商业上使用的植物)中淀粉的直链淀粉/支链淀粉的比例。WO92/14827中描述了迄今为止马铃薯中唯一已知的淀粉分支酶，在本领域中还不知道其它的淀粉分支酶是否与马铃薯分支淀粉的合成有关。在分子基因遗传学(1991)225289-296(Visser等)中描述了通过反义构建体来抑制与颗粒结合的淀粉合成酶基因的表达。在马铃薯块茎淀粉中此酶的抑制作用可达100％，因此可以提供不含直链淀粉的淀粉。然而，现有的抑制支链淀粉的方法还不成功，因此还非常需要抑制支链淀粉的替代性方法(Mülller-Rber和Koβmann，1994；Martin和Smith，1995)。本专利技术的目的在于改变马铃薯淀粉中的支链淀粉的分支程度和支链淀粉/直链淀粉的比例。按照本专利技术，其目的是通过提供一种新型的编码第二种淀粉分支酶(SBE II)的分离的DNA序列和它的片段来达到的，将所说的DNA序列插入到植物的基因组后，可以使再生植株的淀粉分支程度和比例发生变化。SBE II的氨基酸序列和它的片段也包括在本专利技术的范围内。另外，由于遗传密码的简并性而产生的上述DNA序列的变体也包括在本专利技术的范围内。所说的编码SBEII的新型DNA序列(包含3074个核苷酸)以及相应的氨基酸序列(包含878个氨基酸)如SEQ ID No.1所示。一段上述DNA序列的1393个核苷酸长的片段(相当于SEQ ID No.1 DNA序列的核苷酸1007至2399)以及相应的氨基酸序列(包含464个氨基酸)如SEQ ID No.2所示。此外，本专利技术提供了包含所说的分离的DNA序列和在马铃薯中有活性的调节元件的载体。可以将所说的DNA序列以相对于正好在此DNA序列上游的启动子有意义或反义(相反)方向插入到此载体中。此外，本专利技术也提供了产生转基因马铃薯的方法，所说的马铃薯支链淀粉的分支程度降低，这种方法包括下列步骤a)将按照权利要求的载体转移并掺加到马铃薯细胞的基因组中；和b)由转化细胞再生完整的植株。最后，本专利技术提供了所说的转基因马铃薯在产生淀粉方面的用途。结合实验部分和附图来更详细地描述本专利技术，其中附图说明图1为由正常马铃薯(A道)和转基因马铃薯(B道)淀粉提取的蛋白质的SDS聚丙烯酰胺电泳。箭头表明切除的蛋白质带。M道分子量标记蛋白质(kDa)。图2为来源于马铃薯块茎淀粉消化的蛋白质的4种肽序列。实验部分从马铃薯块茎分离淀粉田间种植马铃薯(Solanum tuberosum)。4℃下，将栽培种EarlyPuritan或实质上缺乏与颗粒结合的淀粉合酶I(Svalf Weibull AB，国际申请PCT/SE91/00892)的转基因马铃薯系的去皮块茎在水果榨汁器中匀浆。向含有大部分淀粉的“汁液组分”中，立即加入Tris-HCl(pH 7.5)、连二亚硫酸钠和乙二胺四乙酸(EDTA)，其终浓度分别为50mM、30mM和10mM。使淀粉颗粒沉降30分钟，然后用10倍于柱床体积的洗涤缓冲液(50mM Tris-HCl，pH 7.5，10mM EDTA)洗涤4次。最后用3倍于柱床体积的丙酮将淀粉(即每次洗涤之间在+4℃下静止30分钟沉淀下来的淀粉)洗涤3次，过夜空气干燥，并贮存在-20℃。从块茎淀粉中提取蛋白质85℃下，通过移液管吸打将贮存的淀粉(20g)与200毫升提取缓冲液((50mM Tris-HCl，pH 7.5，2％(w/v)十二烷基硫酸钠(SDS)，5mM EDTA)充分混合，直到淀粉成为胶状。然后将样品在-70℃下冷冻1小时。50℃下解冻后，10℃下将样品以12,000xg离心20分钟。收集上清液，以3,000xg再离心15分钟。将最后的上清液通过0.45μ的滤膜过滤，并加入2.25倍体积冰冷的丙酮。4℃下温育30分钟后，通过离心(4℃下，以3,000xg离心30分钟)收集蛋白质沉淀，然后溶解在50mM Tris-HCl，pH7.5中。按照Laemmli(1970)通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析每种制剂的等份样品(图1)。通过三氯乙酸(10％)沉淀来浓缩余下制剂中的蛋白质，然后在8％ SDS聚丙烯酰胺凝胶上分离这些蛋白质(Laemmli，(1970))。用考马斯亮蓝R-250(在20％甲醇、0.5％乙酸和79.5％ H2O中含有0.2％)将凝胶中的蛋白质染色。肽在凝胶上的消化和测序切下图1中箭头表明的染色的带(相当于表观分子量大约为100kDa)，并于35℃下，在0.2M NH4HCO3的50％乙腈溶液中在不断搅拌下洗涤20分钟，洗涤两次。每次洗涤后，除去液体，使凝胶块在通风橱中通过蒸发干燥。然后将完全干燥的凝胶块分开放置在石蜡膜上，并加入2μl 0.2MNH4CO3和0.02％ Tween-20。使凝胶块吸收改良的胰蛋白酶(Promega，Madison，WI，USA)(2μl中含有0.25μg)，之后加入0.2M NH4CO3，每次5μl，直到凝胶块恢复到原来的大小。然后将凝胶块分成3块，并转移到Eppendorf管中。加入0.2M NH4CO3(200μl)，37℃下将凝胶块中所含的蛋白质过夜消化(Rosenfeld等，1992)。完全消化后，加入三氟乙酸至终浓度为1％，倒出上清液并保存。在37℃下，将所说的凝胶块用60％乙腈、0.1％三氟乙酸(200μl)在连续震荡的情况下再提取两次，每次20分钟。将这两次的上清液与第一次的上清液合并。最后用60％乙腈、0.1％本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：B·爱克，J·科斯努迪，CT·拉森，H·拉森，L·拉斯克，
申请(专利权)人：阿迈罗基因公司，
类型：发明
国别省市：