一种新型磷脂酶D制造技术

本发明专利技术属于酶的基因工程技术领域，具体涉及一种磷脂酶D突变体及其制备与应用。其技术方案是利用重组DNA技术对野生型磷脂酶D基因进行定点突变，得到活力较高的磷脂酶D基因，然后将高活力磷脂酶D基因在枯草芽孢杆菌表达系统、毕赤酵母表达系统(包括毕赤酵母游离表达系统和毕赤酵母细胞表面展示系统)中表达，得到产高活力磷脂酶D的重组菌株，表达后，检测高活力磷脂酶D的比酶活较野生型磷脂酶D提高38‑140％，高活力磷脂酶D在枯草芽孢杆菌表达系统、毕赤酵母表达系统、毕赤酵母表面展示系统内发酵酶活最高值分别为36.8U/ml、48.1U/ml、140.2U/(g·细胞干重)。

A New Phospholipase D

【技术实现步骤摘要】
一种新型磷脂酶D本申请为专利技术专利申请201610402557.7的分案申请，201610402557.7的申请日为2016年6月2日，申请号为201610402557.7，专利技术名称为一种新型磷脂酶D及其制备磷脂酸、磷脂酰丝氨酸的方法。
：本专利技术属于酶的基因工程
，具体涉及通过重叠PCR技术体外定向进化获得比酶活提高的磷脂酶D突变体，并提供由高活力磷脂酶D催化制备磷脂酸和磷脂酰丝氨酸的方法。
技术介绍
：磷脂酶D(PLD)分布广泛，存在于各种动植物和微生物中。PLD对磷脂分子中的磷酰氧键P-O起作用，其生物催化作用主要体现在两种反应：(1)水解磷脂上的末端磷酸酯键生成磷脂酸和羟基化合物；(2)当有另一种含羟基的化合物存在时，可催化磷脂酰基与其结合，形成新的磷脂，即磷脂酰基转移反应。磷脂酸(Phosphatidicacid,PA)是一种简单而又常见的磷脂，广泛存在于动植物细胞中，是动植物细胞生物膜的基本成分。PA由甘油骨架、1或2号位的脂肪酸基团、3号位的磷酸基组成。PA是PLD作用的直接产物，PA能够带动Ca2+激活或协同激活细胞内各种酶，与此同时，PA还可促进细胞有丝分裂、促进细胞内超氧化物的形成、引起肌肉的收缩、促进激素分泌、诱发血小板聚集等作用。基于以上作用，PA可应用在食品工业、医药工业、化妆品等方面。磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine，PS)是一类普遍存在的磷脂，通常位于细胞膜内层，是细胞膜的重要组成部分，由于参与一系列膜功能反应，尤其在人体的神经系统中，是大脑细胞膜的重要组分之一，其对改善记忆力、缓解压力、修复大脑损伤、治疗儿童多动症、抑郁症以及预防老年痴呆症等作用效果显著。但具有一定纯度磷脂酰丝氨酸自然界中含量稀少，故制备纯度高、质量好的磷脂酰丝氨酸产品具有重要意义。酶法制备磷脂酸或磷脂酰丝氨酸是指在一定条件下，用PLD催化底物(如PC)反应生成磷脂酸或磷脂酰丝氨酸，该方法相比化学合成具有反应条件温和、副产物少、产品得率高、质量好等优点。生产磷脂酸或磷脂酰丝氨酸的不同点在于PLD催化反应类型不同，前者属于水解反应，后者则是通过使用PLD的磷脂酰基移转(transphosphatidylation)反应，对磷脂的头基进行修饰。酶分子体外定向进化属于蛋白质的非理性设计，属于蛋白质工程的范畴。通常手段是利用分子生物学手段在分子水平创造出分子的多样性，结合灵敏、高通量的筛选技术，从而能够在短时间内得到理想的突变体。它不需事先了解蛋白质的空间结构、活性位点、催化机制等因素，而是人为地创造特殊的进化条件，模拟自然进化机制，在体外改造酶基因，获得具有某些预期特征的改构酶，与此不同，需要事先了解蛋白质的空间结构、活性位点、催化机制等因素，并根据这些因素有的放矢做对其DNA进行改造的是定点突变。定点突变，又称为理性设计，就是在已知的DNA序列中插入、缺失或取代一定长度的核苷酸序列，由于其迅速、高效的提高DNA所表达的目的蛋白的性状及表征，是基因研究工作中一种非常有用的手段。本专利技术所使用的重叠PCR技术是定点突变技术的一种，该技术可以简单、快速的将两个或多个基因片段通过末端互补、重叠延伸进行体外基因的拼接。重叠PCR技术可以获得依靠限制性内切酶消化难以得到的产物，并且方便快速，在进行大片段基因的定点突变、基因片段删除以及多个编码序列嵌合连接上具有独有的优势。枯草芽孢杆属于革兰氏阳性菌。许多枯草芽孢杆菌在发酵工业上的使用已有相当长的历史，无致病性，不产生任何内毒素，并且属于人体肠道菌促进有益厌氧菌生长，并产生乳酸等有机酸类，降低肠道pH值，间接抑制其它致病菌生长，此外其能够高效地分泌各种蛋白质，在微生物遗传学领域，芽孢杆菌属背景研究的也十分清楚，密码子偏爱性不明显、发酵简单、生长迅速、对培养基无特殊要求等优点。毕赤酵母属于单细胞低等真核生物，是表达外源基因比较理想的工具。它除了具有原核生物易于培养、繁殖快、便于基因工程操作和高密度发酵等特性之外，还因为含有特有的强有力的AOX(醇氧化酶基因)启动子，可用甲醇严格地调控外源基因的表达。另外，培养成本低，产物易分离。所用发酵培养基十分廉价，一般碳源为甘油或葡萄糖及甲醇，其余为无机盐。能够对外源蛋白基因进行稳定遗传，且作为真核表达系统，毕赤酵母具有真核生物的亚细胞结构，具有糖基化、脂肪酰化、蛋白磷酸化等翻译后修饰加工功能。同酿酒酵母等传统真核表达系统相比，毕赤酵母表达系统已成为现代分子生物学研究最重要的工具和模型。此外，毕赤酵母细胞表面展示系统不但具有外源基因的翻译后加工能力和蛋白的折叠加工及适度糖基化等优点，而且，经该系统得到的全细胞催化剂可以重复利用从而降低生产成本。在本专利技术中，高活力磷脂酶D基因及其突变体基因分别在枯草芽孢杆菌表达系统和毕赤酵母表达系统中表达，得到产高活力磷脂酶D，纯化后与底物反应，催化制备磷脂酸、磷脂酰丝氨酸。
技术实现思路
：本专利技术的目的在于提供一种高活力磷脂酶D，及利用其制备磷脂酸和磷脂酰丝氨酸的方法。为了实现上述目的，本专利技术提供的技术方案之一为：一种磷脂酶D突变体，是基于SEQIDNo.2所示的磷脂酶D氨基酸序列，其中的第139、209、256、388、519位中的至少一个氨基酸被置换为以下氨基酸：第139位：Asp139Ile；第209位：Asn209Ile；第256位：Asp256Thr；第388位：Gln388Cys；第519位：Asp519Val；所述突变体的基因，是以郝氏链霉菌(Streptomyceshalstedii)TCCC21102基因组为模板，克隆出磷脂酶D野生型基因plD(如SEQIDNO:1所示)后，通过酶切、连接等构建重组载体，之后由重叠PCR技术对野生型磷脂酶D基因进行定点突变，得到突变体基因(见表1)。为了实现上述目的，本专利技术提供的技术方案之二为：将上述突变体基因重新构建重组载体，并在枯草芽孢杆菌WB600和毕赤酵母GS115中的高效表达，得到产高活力磷脂酶D的重组菌株，通过发酵、提取等技术获得高活力磷脂酶D。为了实现上述目的，本专利技术提供的技术方案之三为：采用本专利技术制备的高活力磷脂酶D分别催化磷脂酰胆碱制备磷脂酸、催化磷脂酰胆碱和丝氨酸制备磷脂酰丝氨酸。在本专利技术中采用如下定义：1.氨基酸和DNA核酸序列的命名法使用氨基酸残基的公认IUPAC命名法，用三字母代码形式。DNA核酸序列采用公认IUPAC命名法。2.磷脂酶D突变体的标识采用“原始氨基酸位置替换的氨基酸”来表示磷脂酶D突变体中突变的氨基酸。如Asn209Ile，表示位置209的氨基酸由野生型磷脂酶D的Asn替换成Ile。位置的编号对应于SEQIDNO：2中磷脂酶D的氨基酸序列编号.核苷酸的变化同样采用“原始核苷酸位置替换的核苷酸”来表示，位置编号对应SEQIDNO：1中野生型磷脂酶D的核苷酸序列编号。在本专利技术中，plD表示野生型磷脂酶D的氨基酸序列，即原始序列(如SEQIDNO：2所示)。用plDm加数字x的方式表示各个突变体，x分别为139、209、256、388、519，其中139代表第139氨基酸由Asp替换成Ile，209代表第209位氨基酸由Asn替换成Ile，256代表第256位氨基酸由Asp替换成Thr，3本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种磷脂酶D突变体，其特征在于，基于SEQ ID No.2所示的磷脂酶D氨基酸序列，发生如下突变：Gln388Cys；或Gln388Cys，Asp519Val。

【技术特征摘要】
1.一种磷脂酶D突变体，其特征在于，基于SEQIDNo.2所示的磷脂酶D氨基酸序列，发生如下突变：Gln388Cys；或Gln388Cys，Asp519Val。2.权利要求1所述磷脂酶D突变体的编码基因。3.权利要求1所述磷脂酶D突变体或权利要求2所述的基因的用途，其特征在于，用于磷脂酸和磷脂酰丝氨酸的制备。4.一种包含权利要求2所述的基因的表达载体或宿主细胞。5.如权利要求4所述的载体或宿主细胞，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘逸寒，路福平，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：天津,12