热稳定和比活提高的植酸酶ECAPPA突变体及其基因和应用制造技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，具体涉及热稳定和比活提高的植酸酶ECAPPA突变体及其基因和应用，氨基酸序列如SEQ ID NO.2的植酸酶的第74，82，97，159，179，376，389，402位氨基酸被突变。相对于原始植酸酶ECAPPA的21％的保留率，突变后植酸酶在80℃处理5分钟，酶活保留率提高到34％‑89％。

ECAPPA Mutant of Phytase with Heat Stability and Specific Activity Improvement and Its Gene and Application

【技术实现步骤摘要】
热稳定和比活提高的植酸酶ECAPPA突变体及其基因和应用
本专利技术涉及生物
，具体涉及热稳定和比活提高的植酸酶ECAPPA突变体及其基因和应用。
技术介绍
植酸(Phytate，Phyticacid，IP6)又称肌醇六磷酸脂，含有6个磷酸基团，带有丰富的磷，是饲料中磷的重要贮存形式。磷是动物体内必须的矿物元素，由于单胃动物体内缺乏分解植酸酶，植酸不能直接被单胃动物利用吸收。植酸酶(Phytase)能够催化植酸及植酸盐水解成肌醇与磷酸(或磷酸盐)。饲料中添加植酸酶，不仅可以提高动物对饲料中植酸磷的利用率，减少磷对环境的污染，还可以降低植酸磷的抗营养作用。植酸酶广泛存在于动物、植物和微生物中，目前市场上商品化的植酸酶均来源与微生物。研究表明来源于大肠杆菌的植酸酶(ECAPPA)是迄今所知的分解植酸能力最强的植酸酶，其pH特性较好，但其热稳定性较差，在制粒高温过程中其活性损失大，使得大肠杆菌植酸酶ECAPPA在颗粒饲料应用受到抑制。颗粒饲料生产过程中有一段短暂的80℃-90℃的喷粉过程，植酸酶的热稳定性使其在颗粒饲料的应用受到抑制。因此怎样提高植酸酶热稳定性是企业提高产品质量的关注焦点。
技术实现思路
本专利技术的目的是通过对来源于大肠杆菌的植酸酶(ECAPPA)进行分子改造，使改造后的植酸酶具有更高的比活，降低生产成本。本专利技术的目的是提供提高比活的植酸酶ECAPPA突变体及其基因。本专利技术采用定点饱和突变的方法对SEQIDNO.10所示的ECAPPA的植酸酶的第74位，第82位，第97位，第159位，第179位，第376位，第389位和第402位进行分子改造，经过高通量筛选得到一系列提高比活的植酸酶突变体。根据本专利技术的热稳定性提高的植酸酶突变体为氨基酸例如SEQIDNO.1所示的植酸酶在以下突变位点发生突变而得，所述突变位点为：(1)G74A，H82S，K97D，N159C，G179Q，F376W，S389Y，G402P；(2)G74C，H82D，K97C，N159Q，G179S，F376W，S389Y，G402P；(3)G74Y，H82Q，K97D，N159Q，G179P，F376Y，S389D，G402Y；(4)G74C，H82Q，K97P，N159P，G179R，F376A，S389Y，G402P；(5)G74A，H82S，K97E，N159P，G179S，F376N，S389Y，G402A；(6)G74C，H82Q，K97Q，N159P，G179Q，F376W，S389Y，G402P；(7)G74Y，H82D，K97E，N159C，G179Q，F376Y，S389D，G402Y；或(8)G74A，H82S，K97P，N159C，G179Q，F376W，S389Y，G402P。本专利技术还提供了编码上述热稳定性提高的植酸酶突变体的基因。本专利技术还提供了一种饲料添加剂，其包含上述热稳定性提高的植酸酶突变体。本专利技术还提供了包含上述突变体基因的重组载体，根据本专利技术的具体实施方式，用于表达所述植酸酶突变体的表达载体是pPICZαA和pPIC9K。本专利技术还提供了包含上述突变体基因的重组菌株，根据本专利技术的具体实施方式，用于所述表达载体的宿主细胞是毕赤酵母X33和GS115。本专利技术还提供了制备上述高热稳定性植酸酶的方法，包括以下步骤：1)用上述重组载体转化宿主细胞，获得重组菌株；2)对重组菌株进行发酵，诱导重组植酸酶的表达。本专利技术植酸酶的氨基酸进行定点饱和突变，再将突变点组合从而得到更优的酶蛋白，一共筛选到8中热稳定性比原始植酸酶高的突变体。相对于原始植酸酶ECAPPA的21％的保留率，突变后植酸酶在80℃处理5分钟，酶活保留率提高到34％-89％。具体实施方式以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。实验材料和试剂：1、菌株与载体大肠杆菌菌株Topl0、大肠杆菌菌株OrigamiB、pET-22b(+)。2、酶与试剂盒Q5高保真PCR扩增酶、限制性内切酶购自NEB(北京)有限公司；质粒提取、DNA胶回收纯化试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。3、培养基大肠杆菌培养基为LB(1％蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％NaCl，pH7.0)。LB-Amp为LB培养基加100ug/mL氨苄青霉素。实施例1、植酸酶基因的合成及克隆以大肠杆菌来源的植酸酶EcAPPA的氨基酸序列作为参考(如SEQIDNO.2所示)，人工合成该基因(核酸序列如SEQIDNO.3所示)。根据基因5'端设计PCR引物含有NdeI内切酶位点，3'端设计PCR引物含EcoRI内切酶位点，引物序列如下：5'端引物NdeI-PHd-F1：GGATTACCATATGATGTCAGATATGAAAAGCGGAAACA3'端引物EcoRI-PHd-R1：CGGAATTCTTATTTGTCTTGATGGAGAGCGCAC以合成基因ECECAPPA为模板，用上述引物进行PCR扩增，将扩增得到的片段切胶回收，用NdeI和EcoRI双酶切，连接到pET-22b(+)载体的NdeI和EcoRI位点，转化Top10大肠杆菌，LB-Amp平板培养获得pET-22b-PHd阳性菌落。实施例2、基因定点饱和突变对植酸酶ECAPPA的氨基酸进行定点饱和突变，分别为第47位，第74位，第82位，第97位，第159位，第179位，第201位，第225位，第253位，第298位，第299位，第376位，第389位和第402位。针对性的设计了14对饱和突变引物，目的基因突变位点统一为NNS，NNS左右各取15个碱基构成正向引物；反向引物与正向引物完全互补，其中，N代表A,T,C,G等四种碱基，S代表C,G两种碱基。以重组载体pET-22b-ECAPPA为模板，加入突变位点的正反向引物，Q5高保真PCR酶进行PCR扩增，产物经DpnI酶切处理后电击转化OrigamiB大肠杆菌感受态细胞，在LB-Amp平板筛选阳性突变重组克隆。每个突变位点挑取186个单克隆接种到96孔深孔板。每个平板挑选3个未突变的克隆为对照。每孔含500uL培养基LB-Amp。37℃摇床200rpm培养5小时，转移50uL菌液到新的96孔平板保种后，平板每孔剩余菌液添加含有IPTG的50uLLB-Amp培养基，并使每孔的IPTG终浓度为0.5mM，37℃摇床200rpm过夜诱导表达植酸酶。含有过夜培养诱导表达植酸酶的酶液在80℃水浴锅加热处理5分钟后，检测培养液中存留植酸酶活性。植酸酶初步耐热活性检测根据中华人民共和国国家标准《GB/T18634-2002》进行。根据植酸酶活性检测结果，植酸酶耐温性高于对照克隆组挑选为阳性克隆。从保种板上挑选阳性克隆集中到96孔平板重复上述的培养、诱导表达、酶活测定筛选试验。确定耐温性提高的为阳性突变克隆，提取阳性克隆质粒DNA进行基因测序。实施例3、组合突变第74位：G74A，G74C，G74Y；第82位：H82D，H82Q，H82S；第97位：K97D，K97C，K97Q，K97E，K97P；第159位：N159C，N本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.热稳定性提高的植酸酶突变体，其特征在于，所述突变体为氨基酸例如SEQ ID NO.1所示的植酸酶在以下突变位点发生突变而得，所述突变位点为：(1)G74A，H82S，K97D，N159C，G179Q，F376W，S389Y，G402P；(2)G74C，H82D，K97C，N159Q，G179S，F376W，S389Y，G402P；(3)G74Y，H82Q，K97D，N159Q，G179P，F376Y，S389D，G402Y；(4)G74C，H82Q，K97P，N159P，G179R，F376A，S389Y，G402P；(5)G74A，H82S，K97E，N159P，G179S，F376N，S389Y，G402A；(6)G74C，H82Q，K97Q，N159P，G179Q，F376W，S389Y，G402P；(7)G74Y，H82D，K97E，N159C，G179Q，F376Y，S389D，G402Y；或(8)G74A，H82S，K97P，N159C，G179Q，F376W，S389Y，G402P。

【技术特征摘要】
1.热稳定性提高的植酸酶突变体，其特征在于，所述突变体为氨基酸例如SEQIDNO.1所示的植酸酶在以下突变位点发生突变而得，所述突变位点为：(1)G74A，H82S，K97D，N159C，G179Q，F376W，S389Y，G402P；(2)G74C，H82D，K97C，N159Q，G179S，F376W，S389Y，G402P；(3)G74Y，H82Q，K97D，N159Q，G179P，F376Y，S389D，G402Y；(4)G74C，H82Q，K97P，N159P，G179R，F376A，S389Y，G402P；(5)G74A，H82S，K97E，N159P，G179S，F376N，S389Y，G402A；(6)G74C，H82Q，K97Q，N159P，G179Q，F376W，S389Y，G402P；(7)G74Y，H82D...

【专利技术属性】
技术研发人员：李阳源，黄江，何小梅，江民华，陈丽芝，高芝，刘金山，唐业，王勇，王平，
申请(专利权)人：广东溢多利生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44