一种碱性磷酸酶的提取方法技术

一种碱性磷酸酶的提取方法，属于酶学领域。所述方法如下：1、取新鲜猪（牛）小肠，刮取肠粘膜。2、将刮取下来的肠粘膜均匀的薄涂在平皿中于冻干机中进行冻干，冻干后磨成粉。3、将肠粘膜装入超临界CO2萃取设备的进料釜中，萃取，完成后保留釜中肠粘膜粗粉。4、向肠粘膜粗粉中加入水，匀质，调pH6.5，加硫酸铵和丙酮，于4℃静置40min，9000r/min离心20min，取上清液加入丙酮，静置，离心，取最终的沉淀物冻干。本发明专利技术的优点是：肠粘膜经过冷冻干燥后，去除掉多余的水分，再经超临界CO2萃取，去除掉多余的脂肪，同时实现了排除水分和脂肪的干扰，并且还具有一定的杀菌作用，较传统工艺要具有更好的碱性磷酸酶的提取效果。

A Method for Extracting Alkaline Phosphatase

【技术实现步骤摘要】
一种碱性磷酸酶的提取方法
本专利技术属于酶学领域，具体涉及一种碱性磷酸酶的提取方法。
技术介绍
碱性磷酸酶（ALP或AKP）是一种单脂磷酸水解酶，广泛分布于人体肝脏、骨骼、肠、肾和胎盘等组织，最终都经肝脏向胆外排出，属于同源二聚体酶。这种酶能催化核酸分子脱掉5'磷酸基团，从而使DNA或RNA片段的5'-P末端转换成5'-OH末端。但它不是单一的酶，而是一组同功酶，即组织非特异性碱性磷酸酶（TNAP）（主要表达于肝、骨骼和肾）、胎盘碱性磷酸酶（PLAP）、生殖细胞碱性磷酸酶（GCAP）和肠碱性磷酸酶（IAP）。IAP是一种经糖基磷脂酰肌醇键锚定于肠上皮细胞顶膜上的糖蛋白。在生理情况下，餐后分泌的胰磷脂酶A2水解胆汁中卵磷脂所生成的溶血卵磷脂能特异性加速IAP经肠上皮细胞顶膜释放入肠腔。肠屏障由四个部分组成，即肠黏膜上皮细胞与细胞间紧密连接构成的机械屏障；肠黏膜上皮细胞分泌的黏液、胃肠道分泌的消化液以及肠道共生菌产生的抑菌物质等组成的化学屏障；肠相关淋巴组织（GALT）及其分泌的免疫活性物质构成的免疫屏障；肠道共生菌与宿主微环境形成的相互依赖、相互作用的生物屏障。肠屏障功能的维持有赖于其四个部分的完整性，任何一个部分的损伤，均会对机体产生不利影响，威胁机体的生命健康。相关研究结果表明，肠碱性磷酸酶（IAP）在维护肠屏障结构的完整性和功能的正常发挥中起到一定的作用。随着生物工程的发展，酶催化反应越来越受到人们的重视。然而，由于在细胞外酶的活性降低及其不稳定性，极大地限制了其在工业上的应用。究其原因，主要是酶在提取和纯化过程中结构的改变。研究表明，酶活性的表现在很大程度上依赖于其分子构象，构象起了变化，活性或功能也随之而变。因此人们深入地探讨酶促反应动力学及影响酶促反应的因素，并通过对酶分子进行改性或改变酶反应的外部环境以提高酶在体外的活性及稳定性。超临界流体（supercriticalfluid，SCF）是指温度及压力处于临界温度及临界压力以上的流体，是一种液气态处于均相中的流体。这种流体兼有液体和气体的优点，黏度小、扩散系数大、密度大，具有良好的溶解性和传质性，且在临界点附近流体对压力和温度的变化非常敏感，既是一种良好的分离介质，又是一种良好的反应介质。此外，由于SCF具有连续变化的物性，可以通过影响其局部作用来控制反应活性和选择性。作为一种非水反应介质，SCF以独特的性质在酶催化领域中受到越来越广泛的关注。所以将酶置于超临界状态下也可使其催化动力学得以改善。以超临界CO2为例，在高压下CO2改变了酶微环境中的pH值，共价修饰蛋白表面的自由氨基并形成氨基甲酸盐，这些氨基甲酸盐改变了赖氨酸残基的电荷，从而改变了酶的活性。目前比较常用的碱性磷酸酶提取技术路线如下：新鲜猪（牛）小肠→刮取肠粘膜→加水，匀质→加正丁醇，匀质→离心（9000r/min，20min）→静置分层，取水相上清液→调pH4.9→离心（9000r/min，20min）→取上清液，加NaOH调pH6.5，加5%硫酸铵，加丙酮→静置40min（4℃），离心（9000r/min，20min）→取上清液加丙酮→静置40min（4℃），离心（9000r/min，20min）→沉淀→冻干。这种方法需要大量的有机溶剂，在利用正丁醇提取脂肪的过程中碱性磷酸酶还会部分残留在有机溶剂中，提取效果欠佳。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了解决目前碱性磷酸酶提取效果不佳的问题，提供一种碱性磷酸酶的提取方法，即超临界CO2萃取法。该方法在实验前先将刮取下来的肠粘膜进行冻干，再通过超临界CO2萃取法去除肠粘膜中的脂肪，该方法有效的去除了肠粘膜中多余的水分和脂肪的干扰，并且超临界CO2萃取法还具有一定的杀菌作用，更有利于后续对碱性磷酸酶的提取。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案如下：一种碱性磷酸酶的提取方法，所述的方法具体步骤如下：步骤一：取新鲜猪小肠或牛小肠，清洗干净，刮取肠粘膜；步骤二：将刮取下来的肠粘膜均匀的涂在平皿中于冻干机中进行冻干，厚度为3~5mm，冻干后磨成粉，粒度不超过100目；步骤三：将上述磨成粉的肠粘膜装入超临界CO2萃取设备的进料釜中，设置萃取压力为20MPa，分离压力为8MPa，萃取分离同时进行，总时间为1.5~2h，得到肠粘膜粗粉；步骤四：按照1：0.8：0.05：0.47的体积比取步骤三得到的肠粘膜粗粉、水、硫酸铵和丙酮，然后向肠粘膜粗粉中加入水，匀质，调节pH为6.5，加入硫酸铵和丙酮，于4℃静置40min，9000r/min离心20min，取上清液额外再加入其1.07体积的丙酮，于4℃静置40min，9000r/min离心20min，取最终的沉淀物冻干即可。本专利技术相对于现有技术的有益效果是：肠粘膜经过冷冻干燥后，去除掉多余的水分，再经超临界CO2萃取，去除掉多余的脂肪，同时实现了排除水分和脂肪的干扰，并且还具有一定的杀菌作用，较传统工艺具有更好的提取效果。具体实施方式下面对本专利技术的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本专利技术技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本专利技术技术方案的精神和范围，均应涵盖在本专利技术的保护范围中。具体实施方式一：本实施方式记载的是一种碱性磷酸酶的提取方法，所述的方法由冻干、超临界CO2萃取法提取、碱性磷酸酶提取三部分组成，所述的方法具体步骤如下：步骤一：取新鲜猪小肠或牛小肠，清洗干净，刮取肠粘膜；步骤二：将刮取下来的肠粘膜均匀的涂在平皿中于冻干机中进行冻干，厚度为3~5mm，冻干后磨成粉，粒度不超过100目；步骤三：将上述磨成粉的肠粘膜装入超临界CO2萃取设备的进料釜中，设置萃取压力为20MPa，分离压力为8MPa，萃取分离同时进行，总时间为1.5~2h，得到肠粘膜粗粉；步骤四：按照1：0.8：0.05：0.47的体积比取步骤三得到的肠粘膜粗粉、水、硫酸铵和丙酮，然后向肠粘膜粗粉中加入水，匀质，调节pH为6.5，加入硫酸铵和丙酮，于4℃静置40min，9000r/min离心20min，取上清液额外再加入其1.07体积的丙酮，于4℃静置40min，9000r/min离心20min，取最终的沉淀物冻干即可。所述的超临界CO2萃取设备购自江苏华安科研仪器有限公司，型号为HA121-50-01。具体实施方式二：具体实施方式一所述的一种碱性磷酸酶的提取方法，步骤二中，所述的冻干具体为：-40℃预冻40min后，-40℃运行120min，-35℃运行120min，-30℃运行360min，-25℃运行360min，-15℃运行360min，0℃运行120min，10℃运行120min，20℃运行360min。具体实施方式三：具体实施方式一所述的一种碱性磷酸酶的提取方法，步骤四中，使用1M的NaOH来调节pH。具体实施方式四：具体实施方式一所述的一种碱性磷酸酶的提取方法，步骤四中，所述的冻干具体为：-40℃预冻40min后，-40℃运行120min，-35℃运行120min，-30℃运行360min，-25℃运行360min，-15℃运行360min，0℃运行120min，10℃运行120min，20℃运行360min。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种碱性磷酸酶的提取方法，其特征在于：所述的方法具体步骤如下：步骤一：取新鲜猪小肠或牛小肠，清洗干净，刮取肠粘膜；步骤二：将刮取下来的肠粘膜均匀的涂在平皿中于冻干机中进行冻干，厚度为3~5mm，冻干后磨成粉，粒度不超过100目；步骤三：将上述磨成粉的肠粘膜装入超临界CO2萃取设备的进料釜中，设置萃取压力为20MPa，分离压力为8MPa，萃取分离同时进行，总时间为1.5~2h，得到肠粘膜粗粉；步骤四：按照1：0.8：0.05：0.47的体积比取步骤三得到的肠粘膜粗粉、水、硫酸铵和丙酮，然后向肠粘膜粗粉中加入水，匀质，调节pH为6.5，加入硫酸铵和丙酮，于4℃静置40min，9000r/min离心20min，取上清液额外再加入其1.07体积的丙酮，于4℃静置40min，9000r/min离心20min，取最终的沉淀物冻干即可。

【技术特征摘要】
1.一种碱性磷酸酶的提取方法，其特征在于：所述的方法具体步骤如下：步骤一：取新鲜猪小肠或牛小肠，清洗干净，刮取肠粘膜；步骤二：将刮取下来的肠粘膜均匀的涂在平皿中于冻干机中进行冻干，厚度为3~5mm，冻干后磨成粉，粒度不超过100目；步骤三：将上述磨成粉的肠粘膜装入超临界CO2萃取设备的进料釜中，设置萃取压力为20MPa，分离压力为8MPa，萃取分离同时进行，总时间为1.5~2h，得到肠粘膜粗粉；步骤四：按照1：0.8：0.05：0.47的体积比取步骤三得到的肠粘膜粗粉、水、硫酸铵和丙酮，然后向肠粘膜粗粉中加入水，匀质，调节pH为6.5，加入硫酸铵和丙酮，于4℃静置40min，9000r/min离心20min，取上清液额外再加入其1.07体积的丙酮，于4℃静置40min，9000r/min离心20min，取最终的沉淀物冻干即可...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘容旭，杨红，李志如，谢智鑫，王子欢，王宇聪，刘丹怡，杨宏博，王钰堡，韩建春，
申请(专利权)人：东北农业大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江,23