本发明专利技术公开一种来源于骨髓间充质干细胞外泌体‑阿霉素纳米靶向药物的制备及体外抗骨肉瘤的研究。包括如下步骤：（1）以无血清培养基培养BM‑MSC，并用外泌体提取试剂盒提取外泌体。（2）将外泌体与盐酸阿霉素按一定比例混合，加三乙胺脱盐，后将混合液置于透析袋4°C过夜制备外泌体‑阿霉素药物。（3）将制备的药物置于酶标仪，于490 nm处测量其吸收峰，计算药物的包载量。（4）将制备的药物用于体外抗骨肉瘤MG63细胞的疗效研究。本方法选择的MSC具有体内毒副作用小、低免疫原性、肿瘤靶向性及可体外大量扩增等优点，结合外泌体在体内广泛分布及具有归巢性的优点，其包载阿霉素后可有效地增强阿霉素对骨肉瘤细胞的杀伤作用。
Preparation of adriamycin nano-targeted drug derived from bone marrow mesenchymal stem cells and its anti-osteosarcoma effect in vitro
【技术实现步骤摘要】
一种来源于骨髓间充质干细胞外泌体-阿霉素纳米靶向药物的制备及体外抗骨肉瘤的研究
本专利技术涉及一种来源于骨髓间充质干细胞外泌体-阿霉素纳米靶向药物的制备方法及抗骨肉瘤的研究。
技术介绍
药物载体是指天然或合成的高分子材料，以不同的形式与药物分子通过化学键结合、物理吸附或包裹，构成药物控制系统。纳米药物载体由于具有颗粒小，稳定性高及靶向性等优点，越来越受到研究者的重视。目前，有许多纳米材料被用来作为纳米药物载体，如纳米金颗粒、碳纳米管、纳米胶束及脂质体、聚合物纳米粒子等。在这些纳米载体中，基于脂质体的纳米载体由于具有良好的生物相容性及降解性、磷脂膜易突破质膜、容易将药物与周围环境分离以及能够与亲水和疏水的胶囊结合等优点而越来越被广泛应用。然而，尽管这些脂质纳米载体在疗效和靶向方面取得了巨大的成功，但其具有易引起宿主免疫系统的免疫排斥反应等缺点。为了克服这一缺点，天然的微粒如细菌、病毒、红细胞、巨噬细胞、淋巴细胞、干细胞和外显子等，由于具有天然的倾向性，可高选择性及高效地进入靶细胞，近年来已被广泛开发用作药物传递载体。在所有这些天然微粒中，外泌体由于在生物流体中的广泛分布和固有的归巢能力，被认为是一种很有应用前景的天然微粒。外泌体是一种直径在30-100nm之间的一种纳米膜囊，具有与质膜方向相同的双脂膜，能够携带蛋白质和遗传物质，在细胞间通讯中起着重要作用。其在生物体内广泛分布，具有内在的归巢能力及可穿透血脑屏障等优良性能，被认为是一种理想的药物载体。已知许多类型的细胞，如上皮细胞、造血细胞、肿瘤细胞和间充质干细胞（MSCS）等可分泌外体。在这些细胞中，间充质干细胞因具有良好的性能，如体外扩增能力强、肿瘤靶向性、低免疫原性和副作用，被认为是理想的可外体大规模生产外泌体的候选细胞。下面所述为本专利技术人提出本研究利用来源于骨髓间充质干细胞（BM-MSCs）的外泌体作为纳米载体，装载化疗药物阿霉素（DOX）用于骨肉瘤的治疗。与游离DOX相比，外泌体-DOX（Exo-Dox）具有较好的体外抗骨肿瘤作用。此外，这些BM-MSC外泌体对骨肉瘤细胞株无明显细胞毒性作用，这可能使其成为一种良好的肿瘤靶向药物纳米载体。
技术实现思路
本专利技术的目的是制备一种来源于骨髓间充质干细胞外泌体-阿霉素纳米靶向药物并用于体外抗骨肉瘤的研究。为实现专利技术目的，本专利技术采用如下技术方案：（1）骨髓间充质干细胞的培养：间充质干细胞生长到融合度70%-80%时，更换无血清培养基培养48个小时，接着收集其培养基用于外泌体的提取。（2）外泌体的提取：将收集的培养基于4°C，3000g离心10分钟，用于清除细胞及细胞碎片；接着将外泌体提取试剂盒中的试剂按1:4的比例与培养基混合，涡旋震荡1分钟后常温放置2小时后，将混合液于4°C、10000g离心60分钟用于分离外泌体，将上清液吸干净后，每10mL培养基用100uLPBS重悬，然后将重悬液置于外泌体纯化柱中于4°C、3000g离心10分钟获取最终外泌体。（3）外泌体-阿霉素纳米靶向药物的制备：将盐酸阿霉素粉末用无菌注射用水稀释至1mg/mL,接着将70ul1mg/mL的外泌体与930ul1mg/mL盐酸阿霉素混合，静置30分钟后，加三乙胺去盐，常温放置60分钟后将混合液移至透析袋，于4°C过夜，计算其包载量和释放度。（4）外泌体-阿霉素靶向药物的包载量计算：将制备的外泌体-阿霉素靶向药物置于酶标仪，于490nm处测量其吸收峰，计算药物的包载量。（5）外泌体-阿霉素靶向药物体外释放实验：将3mL包载好的外泌体-阿霉素药物置于透析袋，并分别放置于pH7.4与pH4.5的PBS溶液中，分别于1、2、4、8、12、24以及36细胞时通过酶标仪测定阿霉素的浓度，计算外泌体-阿霉素靶向药物的释放度。（6）外泌体-阿霉素靶向药物体外抗骨肉瘤的研究：首先，在96孔板中每孔接种3000个MG63细胞，用完全培养基于37°C、5%CO2培养箱中孵育24小时后，分别加入0、0.25、0.5、1、5、10、20、50、100ug/mL的阿霉素及相同浓度阿霉素的外泌体-阿霉素药物。24小时后，将CCK8溶液加入孔中测量细胞的活力。本专利技术上述的一种来源于骨髓间充质干细胞外泌体-阿霉素在制备治疗骨肉瘤的纳米靶向药物中的应用。与现有的纳米药物载体相比，本专利技术的特点为：结合了间充质干细胞的体外扩增能力强、肿瘤靶向性、低免疫原性、低副作用以及外泌体在生物体内广泛分布、具有内在的归巢能力及可穿透血脑屏障等两者的优良性能，克服了目前纳米载体药物出现的免疫原性及体外不易大量扩增等缺点，通过对骨肉瘤细胞MG63体外抗肿瘤效果的研究，发现与单纯的阿霉素药物相比，外泌体载阿霉素具有较强的抗肿瘤疗效，其半数致死量（IC50）较单纯阿霉素低。此外，这些来源于骨髓间充质干细胞的外泌体对骨肉瘤细胞株无明显细胞毒性作用，这可能使其成为一种良好的肿瘤靶向药物纳米载体。附图说明图1为本专利技术的透射电镜（TEM），图中的（A）为外泌体的透射电镜（TEM），图中的（B）为外泌体-阿霉素的透射电镜（TEM）。图1-1为本专利技术的粒径表征图，图中的（C）为外泌体粒径表征图，图中的（D）为外泌体-阿霉素的粒径表征图。图2为本专利技术的外泌体-阿霉素纳米药物在不同pH中的释放曲线。图3为本专利技术的用CCK8检测外泌体-阿霉素纳米药物体外抗骨肉瘤MG63活性。具体实施方式为了使本专利技术要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。本专利技术实施例是这样实现的，一种来源于骨髓间充质干细胞外泌体-阿霉素纳米靶向药物的制备及体外抗骨肉瘤的研究，包括如下步骤：（1）骨髓间充质干细胞的培养：间充质干细胞生长到融合度70%-80%时，更换无血清培养基培养48个小时，接着收集其培养基用于外泌体的提取。（2）外泌体的提取：将收集的培养基于4°C，3000g离心10分钟，用于清除细胞及细胞碎片。接着将外泌体提取试剂盒中的试剂按体积比为1:4的比例与培养基混合，涡旋震荡1分钟后常温放置2小时，接着将混合液于4°C，10000g离心60分钟用于分离外泌体，将上清液吸干净后，每10ml培养基用100ulPBS重悬，然后将重悬液置于外泌体纯化柱（购外泌体提取试剂盒配送的）于4°C、3000g离心10分钟获取最终外泌体。（3）外泌体-阿霉素纳米靶向药物的制备：将盐酸阿霉素粉末用无菌注射用水稀释至1mg/mL,接着将70ul1mg/mL步骤（2）制得的外泌体与930ul1mg/mL盐酸阿霉素混合，静置30分钟后，加三乙胺去盐，去盐后常温放置60分钟后将混合液移至透析袋，于4°C过夜，图1中的B为制备的外泌体-阿霉素纳米靶向药物的表征图。（4）外泌体-阿霉素靶向药物的包载量计算：将制备的外泌体-阿霉素靶向药物置于酶标仪，于490nm处测量其吸收峰，计算药物的包载量，本专利技术的所制备的药物包载量在12.5%-15%之间。（5）外泌体-阿霉素靶向药物体外释放实验：将3mL包载好的外泌体-阿霉素药物置于透析袋，并分别放置于pH7.3与pH4.5的PBS溶液中，分别于1、2、4、8、12、24以及36细胞时通过酶本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种来源于骨髓间充质干细胞外泌体‑阿霉素在制备治疗骨肉瘤的纳米靶向药物中的应用。
【技术特征摘要】
1.一种来源于骨髓间充质干细胞外泌体-阿霉素在制备治疗骨肉瘤的纳米靶向药物中的应用。2.一种来源于骨髓间充质干细胞的外泌体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）骨髓间充质干细胞的培养：间充质干细胞生长到融合度70%-80%时，更换无血清培养基培养48个小时，接着收集其培养基用于外泌体的提取；（2）外泌体的提取：将收集的培养基于4°C，3000g离心10分钟，用于清除细胞及细胞碎片；接着将外泌体提取试剂盒中的试剂按体积比为1:4的比例与培养基混合，涡旋震荡1分钟后常温放置2小时，接着将混合液于4°C，10000g离心60分钟用于分离外泌体，将上清液吸干净后，每10mL培养基用100uLPBS重悬，然后将重悬液置于外泌体纯化柱中于4°C，3000g离心10分钟获取最终外泌体。3.一种外泌体-阿霉素纳米靶向药物的制备方法，其特征在于，步骤如下：将盐酸阿霉素粉末用无菌注射用水稀释至1mg/mL,接着将70ul1mg/mL的权利要求2制备的外泌体与930ul1mg/mL盐酸阿霉素混合，静置...
【专利技术属性】
技术研发人员：钟光贤，陈锦元，魏洪翔，吴朝阳，林建华，
申请(专利权)人：福建医科大学附属第一医院，
类型：发明
国别省市：福建,35
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