环形荧光探针介导的高灵敏、高特异性等温核酸扩增方法及其应用技术

本发明专利技术涉及环形荧光探针介导的高灵敏度、高特异性等温核酸扩增方法及其应用。所述等温核酸扩增方法包括将待检测核酸样品在结构特异性核酸内切酶、DNA聚合酶和环形荧光探针的作用下进行核酸扩增的步骤。本发明专利技术的环形荧光探针介导的等温核酸扩增方法使用了FEN1酶，在等温扩增领域实现了探针法的信号监测方式，具有高度的特异性和敏感性，并且具有良好的检测限，最低检测限为10拷贝/反应；所述方法能够同时检测DNA和RNA样本，应用范围广泛；并且所述方法的诊断效能与传统金标准方法相比无显著差异，说明本发明专利技术提供的环形荧光探针介导的等温核酸扩增方法在核酸分析、临床诊断等领域具有广阔的应用前景。

High sensitivity and specificity isothermal nucleic acid amplification mediated by circular fluorescent probe and its application

【技术实现步骤摘要】
环形荧光探针介导的高灵敏、高特异性等温核酸扩增方法及其应用
本专利技术属于核酸扩增
，具体涉及环形荧光探针介导的高灵敏、高特异性等温核酸扩增方法及其应用。
技术介绍
核酸检测是生物医学研究中一种广泛应用的重要方法，其在感染性病原体诊断的应用中具有重要的临床价值。PCR作为核酸检测中的金标准方法，具有高度的特异性及敏感性等优点，但其操作复杂，对仪器及人员的要求都较高，限制了其在床旁检测及现场快速检测中的应用。为了克服PCR方法的缺陷，一大类等温核酸扩增方法相继出现，如重组酶聚合酶扩增(RPA)、环介导等温扩增技术(LAMP)、链替代扩增技术(SDA)、依赖于解旋酶的等温扩增技术(HAD)及交叉引物扩增(CPA)等。这些方法在恒温的条件下进行反应，对仪器的要求显著下降，适宜于现场快速检测。目前监测这些恒温扩增反应进程的手段主要是应用嵌入式荧光染料的方法，然而这是一种非模板依赖的检测方法，容易导致假阳性结果，影响检测的特异度，进而产生误诊。FEN1(FlapEndonucleaseI)是一种结构特异性的多功能核酸酶，具有5’→3’flap核酸内切酶(FEN)、缺口核酸内切酶(GEN)和核酸外切酶(EXO)三种酶切活性。FEN1与大多数人们所知的识别特定核酸序列的限制性内切酶不同，FEN1所识别的DNA底物与其序列无关，而只识别特定的DNA结构。BstDNA聚合酶具有5’→3’聚合酶活性，但没有3’→5’外切酶活性，该酶介导的等温扩增具有快速、灵敏、特异性强等优点。儿童感染性腹泻是一类临床多发病和常见病，严重威胁着儿童的生命健康，常年居于造成儿童病死率的前三位，且在发展中国家该疾病的情况更为严重。造成儿童感染性腹泻的病原体类型十分繁多，其中轮状病毒、星状病毒及腺病毒是造成感染的常见病原体，目前用于诊断这些病毒的方法主要包括免疫学方法及以PCR为基础的核酸检测方法，这些方法常常需要繁琐的操作程序、较为昂贵的仪器设备，专业的技术人员以及易出现假阳性或假阴性结果。轮状病毒是引起婴幼儿腹泻的主要病原体之一，其主要感染小肠上皮细胞，从而造成细胞损伤，引起腹泻。轮状病毒每年在夏秋冬季流行，感染途径为粪－口途径，临床表现为急性胃肠炎，呈渗透性腹泻病，病程一般为7天，发热持续3天，呕吐2～3天，腹泻5天，严重出现脱水症状。轮状病毒(Rotavirus，简称RV)是一种双链核糖核酸病毒，属于呼肠孤病毒科。它是婴儿与幼儿腹泻的单一主因，几乎世界上每个大约五岁的小孩都曾感染过轮状病毒至少一次。然而，每一次感染后人体免疫力会逐渐增强，后续感染的影响就会减轻，因而成人就很少受到其影响。星状病毒(Astrovirus，简称AS)现在被认为是引起免疫系统不发达的儿童以及老年人出现急性病毒性胃肠炎的重要病原之一。在粪便和上皮细胞中存在病毒颗粒表明该病毒在人的胃肠道中复制并繁殖。人类感染星状病毒的主要症状是腹泻、恶心、呕吐和发烧。一些研究表明，该病毒引起的急性病毒性胃肠炎的潜伏期大约是三到四天。在PCR中常用的TaqMan探针法具有高度的特异性，然而等温扩增反应中常用的BstDNA聚合酶缺乏剪切探针的能力，故类似TaqMan探针的高特异性检测方法在等温扩增中难以实施。
技术实现思路
专利技术要解决的问题本专利技术的目的之一，在于提供一种由BstDNA聚合酶、结构特异性核酸内切酶FNE1和环形荧光探针介导的等温核酸扩增方法。本专利技术的又一目的，在于提供一种具有高灵敏度、高特异性的等温核酸扩增体系，其特征在于，所述等温核酸扩增体系中包含BstDNA聚合酶、结构特异性核酸内切酶FNE1和环形荧光探针。本专利技术的另一目的，在于提供一种利用上文所述的等温核酸扩增体系在制备检测儿童腹泻病原体的试剂中的应用。用于解决问题的方案本专利技术人鉴于上述现有技术中存在的问题，进行了深入的研究、反复试验，发现为了在等温扩增中实现探针法的信号监测，必须引入一种具有剪切探针能力的核酸酶，且这种核酸酶的反应温度及适宜缓冲液条件需要与BstDNA聚合酶相同或相近。本专利技术人采用结构特异性核酸内切酶FEN1与BstDNA聚合酶组合，开发了一种新型的环形荧光探针介导的等温核酸扩增方法(CircularFluorescentProbeMediatedIsothermalNucleicAcidAmplification，CFPA)，并将其应用于常见的儿童腹泻病原体(如轮状病毒、星状病毒和/或腺病毒)的诊断，从而完成了本专利技术。即，本专利技术如下所述：本专利技术提供了一种环形荧光探针介导的等温核酸扩增方法，其特征在于，所述方法包括将待检测核酸样品在结构特异性核酸内切酶、DNA聚合酶和环形荧光探针的作用下进行核酸扩增的步骤。其中，所述结构特异性核酸内切酶为FEN1，所述DNA聚合酶为BstDNA聚合酶，所述环形荧光探针包含正向环形荧光探针和反向环形荧光探针，所述待检测核酸样品为轮状病毒或星状病毒；优选的，所述环形荧光探针标记荧光基团和淬灭基团，其中所述荧光基团选自FAM、HEX、VIC、TET、CY5、TexasRed、JOE或TFAM；所述淬灭基团选自BHQ1、BHQ2、TAMRA、Dabcyl、Eclipse或MGB。根据本专利技术所述的等温核酸扩增方法，其特征在于：(i)当所述待检测核酸样品为轮状病毒时，所述正向环形荧光探针和反向环形荧光探针的核苷酸序列分别如SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示；优选的，在所述正向环形荧光探针和反向环形荧光探针的5’端均标记FAM荧光基团，在SEQIDNO：1的第11位碱基和SEQIDNO：2的第12位碱基上分别标记TAMRA淬灭基团；(ii)当所述待检测核酸样品为星状病毒时，所述正向环形荧光探针和反向环形荧光探针的核苷酸序列分别如SEQIDNO：3和SEQIDNO：4所示；优选的，在所述正向环形荧光探针和反向环形荧光探针的5’端均标记HEX荧光基团，在SEQIDNO：3的第9位碱基和SEQIDNO：4的第8位碱基上分别标记BHQ1淬灭基团。本专利技术还提供了一种环形荧光探针介导的等温核酸扩增体系，其特征在于，所述体系包括结构特异性核酸内切酶、DNA聚合酶和环形荧光探针，优选的，所述等温核酸扩增体系中还进一步包括待检测核酸样品。其中，所述结构特异性核酸内切酶为FEN1，所述DNA聚合酶为BstDNA聚合酶，所述环形荧光探针包含正向环形荧光探针和反向环形荧光探针，所述待检测核酸样品为轮状病毒或星状病毒；优选的，所述环形荧光探针标记荧光基团和淬灭基团，其中所述荧光基团选自FAM、HEX、VIC、TET、CY5、TexasRed、JOE或TFAM；所述淬灭基团选自BHQ1、BHQ2、TAMRA、Dabcyl、Eclipse或MGB；更优选的，(i)当所述待检测核酸样品为轮状病毒时，所述正向环形荧光探针和反向环形荧光探针的核苷酸序列分别如SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示；(ii)当所述待检测核酸样品为星状病毒时，所述正向环形荧光探针和反向环形荧光探针的核苷酸序列分别如SEQIDNO：3和SEQIDNO：4所示。进一步的，在本专利技术所述的等温核酸扩增体系中还包含荧光染料，所述荧光染料选自HEX、Cy5、VIC、Cy3或NED。在所述等温核酸扩增体系中还包括：Tris本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种环形荧光探针介导的等温核酸扩增方法，其特征在于，所述方法包括将待检测核酸样品在结构特异性核酸内切酶、DNA聚合酶和环形荧光探针的作用下进行核酸扩增的步骤。

【技术特征摘要】
1.一种环形荧光探针介导的等温核酸扩增方法，其特征在于，所述方法包括将待检测核酸样品在结构特异性核酸内切酶、DNA聚合酶和环形荧光探针的作用下进行核酸扩增的步骤。2.根据权利要求1所述的环形荧光探针介导的等温核酸扩增方法，其特征在于，所述结构特异性核酸内切酶为FEN1，所述DNA聚合酶为BstDNA聚合酶，所述环形荧光探针包含正向环形荧光探针和反向环形荧光探针，所述待检测核酸样品为轮状病毒或星状病毒；优选的，所述环形荧光探针标记荧光基团和淬灭基团，其中所述荧光基团选自FAM、HEX、VIC、TET、CY5、TexasRed、JOE或TFAM；所述淬灭基团选自BHQ1、BHQ2、TAMRA、Dabcyl、Eclipse或MGB。3.根据权利要求2所述的环形荧光探针介导的等温核酸扩增方法，其特征在于：(i)当所述待检测核酸样品为轮状病毒时，所述正向环形荧光探针和反向环形荧光探针的核苷酸序列分别如SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示；优选的，在所述正向环形荧光探针和反向环形荧光探针的5’端均标记FAM荧光基团，在SEQIDNO：1的第11位碱基和SEQIDNO：2的第12位碱基上分别标记TAMRA淬灭基团；(ii)当所述待检测核酸样品为星状病毒时，所述正向环形荧光探针和反向环形荧光探针的核苷酸序列分别如SEQIDNO：3和SEQIDNO：4所示；优选的，在所述正向环形荧光探针和反向环形荧光探针的5’端均标记HEX荧光基团，在SEQIDNO：3的第9位碱基和SEQIDNO：4的第8位碱基上分别标记BHQ1淬灭基团。4.一种环形荧光探针介导的等温核酸扩增体系，其特征在于，所述体系中包括结构特异性核酸内切酶、DNA聚合酶和环形荧光探针，...

【专利技术属性】
技术研发人员：方雪恩，叶辛，孔继烈，
申请(专利权)人：上海速创诊断产品有限公司，上海速芯生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31