一种利用二磷酸尿嘧啶脱氧核苷酸检测核酸中腺嘌呤N6位发生甲基化修饰的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用二磷酸尿嘧啶脱氧核苷酸检测核酸中腺嘌呤N6位发生甲基化修饰的方法。该检测方法主要由两部分组成。第一部分是对被测核酸或对照核酸通过延伸反应将二磷酸尿嘧啶脱氧核苷酸（dUDP）掺入基因组序列。第二部分是使用变性聚丙烯酰胺凝胶分析延伸反应结果，经数据处理后得到被测核酸或对照核酸的延伸百分比，进行比较从而实现识别检测N

A METHOD FOR DETECTING METHYLATION OF ADENOPINE N6 IN NUCLEIC ACID WITH URIDE DIPHOSPHATE DEOXYNUCLEOTIDE

【技术实现步骤摘要】
一种利用二磷酸尿嘧啶脱氧核苷酸检测核酸中腺嘌呤N6位发生甲基化修饰的方法
本专利技术属于分子生物学、核酸化学和表观遗传学(Epigenetic)领域，具体涉及一种基因组中N6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenine)的识别检测方法。
技术介绍
表观遗传学作为遗传学的一门重要分支学科，主要研究基于非基因序列改变所引起的基因表达的可遗传的变化。其作用机制主要包括：DNA甲基化、染色质重塑、非编码RNA调控、组蛋白修饰等。表观遗传学与众多生命功能有关，例如基因组印记、X-染色体失活等。同时研究表明，表观遗传学与癌症、免疫系统疾病、数种遗传性的智力迟钝疾病等疾病的发生存在重要关联。DNA的表观遗传学修饰主要分为两大类，一是胞嘧啶上C5位的甲基化修饰，称之为5-甲基胞嘧啶(5mC)；第二类为腺嘌呤上N6位发生甲基化修饰，我们把它称之为N6-甲基腺嘌呤。这两种不同的表观遗传修饰不仅存在着生物体分布位置和含量的差异，同时他们所承担的生物学功能也完全不同。例如，5-甲基胞嘧啶主要分布于哺乳动物以及其他真核生物中，对于基因的选择性表达、基因的稳定性、个体发育及疾病的发生都起着至关重要的作用。然而在原核生物和一些低等的真核生物中，N6-甲基腺嘌呤则取代5-甲基胞嘧啶成为主要的表观遗传学修饰，并执行其特定的生物学功能。在过去很长的一段时间里，由于检测手段的限制，N6-甲基腺嘌呤—直被认为只分布于细菌的DNA中。随着检测技术的发展，研究人员发现N6-甲基腺嘌呤也存在于一些真核生物中，同时其潜在的表观遗传学功能也逐步被揭示。例如，可能也携带有重要的表观遗传学信息，并且能够在子代中进行遗传传递等。不同于DNA，已知RNA存在超过100种修饰。而随着更多表观遗传修饰物功能的揭示，人们发现，除了将遗传信息从DNA传递至蛋白质，mRNA本身也会参与许多生物学过程。N6-甲基腺嘌呤广泛存在于哺乳动物的mRNA以及非编码RNA中，平均在每条mRNA上就存在3～5个N6-甲基腺嘌呤修饰碱基。此外，人们已经发现，N6-甲基腺嘌呤的分布具有一定的特征。首先，它们集中分布在终止密码子附近以及内部长的外显子中，这说明N6-甲基腺嘌呤很可能在mRNA的翻译调控和RNA的选择性拼接中都发挥很重要的作用。另外，人们还发现N6-甲基腺嘌呤广泛存在于3’UTRs中，而这些区域中的N6-甲基腺嘌呤极有可能影响自身与RNA结合蛋白的结合力，进而影响RNA的一系列生物学过程。同时，还有课题组发现3’UTRs中N6-甲基腺嘌呤总是恰好分布在miRNA结合区域之前，并推测N6-甲基腺嘌呤会影响miRNA诱导的转录本降解以及翻译抑制。他们还通过分析，发现含有N6-甲基腺嘌呤的基因很多还与RNA代谢，细胞间信号传递，以及神经系统疾病相关。在转录组水平，不同类型的mRNA有不同丰度的N6-甲基腺嘌呤修饰。而且，N6-甲基腺嘌呤在不同的细胞阶段和不同的组织样本中，含量都不一样。因此，N6-甲基腺嘌呤很可能在RNA代谢和生长发育中起着很重要的作用。目前，人们已经发现了它的一些重要功能，包括mRNA的剪接，mRNA的出核，mRNA的翻译，加速mRNA的降解从而降低mRNA稳定性，影响生物钟的维持、细胞周期的调节以及哺乳动物胚胎干细胞的分化。由此可见，N6-甲基腺嘌呤在哺乳动物的多种生物学过程中都发挥着难以替代的重要作用。逐渐深入的研究表明，DNA与RNA中的N6-甲基腺嘌呤具有不可替代的研究价值，而其检测方法的便捷高效性对其功能特点、作用机理等的进一步研究的影响就愈发关键。现有的N6-甲基腺嘌呤主要检测方法包括超高效液相色谱-串联质谱法(Ultra-HighPerformanceLiquidChromatography-tandemMassSpectrometry，UHPLC-MS/MS)、单细胞实时测序(Singlemoleculerealtimesequencing，SMRT)等方法。尽管这些方法能够达到检测N6-甲基腺嘌呤的目的，但是它们仍存在一些局限性。例如单细胞实时测序法难以识别N6-甲基腺嘌呤和N1-甲基腺嘌呤这些结构相似的修饰类型；而其他方法步骤繁琐或者设备昂贵。
技术实现思路
为了解决现有技术存在的缺陷与不足，本专利技术的目的是提供一种无需使用昂贵仪器、无繁琐步骤、环境友好、实用性强且能高效、特异并灵敏地识别检测核酸中N6-甲基腺嘌呤的方法。本专利技术通过如下技术方案完成：本专利技术提供了一种利用二磷酸尿嘧啶脱氧核苷酸识别带有N6-甲基腺嘌呤的核酸的方法，具体包括：(1)以二磷酸尿嘧啶脱氧核苷酸(dUDP)作为DNA合成的原料，在紧邻疑为N6-甲基腺嘌呤的位点上游根据模板链序列设计一条长度为17-20bp的引物，在DNA聚合酶或逆转录酶作用下与核酸共孵育进行延伸反应，以将二磷酸尿嘧啶脱氧核苷酸(dUDP)掺入序列，所述核酸为疑为含N6-甲基腺嘌呤的位点的待测核酸或对照核酸，所述对照核酸为对应位点不含N6-甲基腺嘌呤、序列与待测核酸相近且其他位点含N6-甲基腺嘌呤水平与待测核酸相同的核酸；(2)步骤(1)延伸产物通过变性聚丙烯酰胺凝胶分析，经凝胶成像仪测定被延伸的底物浓度和未被延伸的底物浓度，得到延伸百分比，所述延伸百分比为：延伸百分比＝被延伸的底物浓度/(被延伸的底物浓度+未被延伸的底物浓度)；(3)结果判定：如果待测核酸的延伸百分比小于对照核酸的延伸百分比，即可识别带有N6-甲基腺嘌呤的核酸。优选地，步骤(1)所述的引物的5’端修饰有FAM。优选地，步骤(1)所述DNA聚合酶为BstDNA聚合酶。优选地，步骤(1)所述逆转录酶为M-MuLV逆转录酶。第二方面，提供二磷酸尿嘧啶脱氧核苷酸在制备识别带有N6-甲基腺嘌呤的核酸的检测试剂中的应用。本专利技术技术方案的原理是：当以dUDP为合成原料时，利用含N6-甲基腺嘌呤的核酸链与含未修饰的腺嘌呤的核酸链在DNA聚合酶或逆转录酶催化下的延伸反应速率的显著差别，获得甲基化修饰位点的准确信息。本专利技术的优点和有益效果1.本专利技术不受检出限与待测序列长度的限制，本专利技术的检测结果由量化的延伸效果(百分比)分析而来，当以dUDP为合成原料时，利用含N6-甲基腺嘌呤的核酸链与含未修饰的腺嘌呤的核酸链在DNA聚合酶或逆转录酶催化下的延伸反应速率的显著差别，获得甲基化修饰位点的准确信息。同时，由于DNA聚合酶或逆转录酶催化下的延伸反应速率极快，未经修饰的序列在本专利技术技术方案下进行的延伸反应时间不存在显著差别，因此检测的分辨率依然能获得保证，这种优势使得本专利技术能适应较大长度范围的核酸链样本检测，完善其应用价值；2.本专利技术为研究疾病的发病机制提供了便利：当前研究已发现某些癌症的发病机制涉及基因组中特定位点的甲基化修饰，而受限于检测手段，其甲基化修饰的类型无法被准确获知。本专利技术在全基因组序列及可能存在的修饰位点已知的情况下，进一步完善对腺嘌呤甲基化类型的探究，从而准确了解病理病因并针对性开发特效药物；3.本专利技术为癌症等疾病的早期诊断提供了新思路：癌症的早期检测已有血项检查、抗原-抗体杂交等方式，其局限性在于设计检测试剂成本高昂，步骤繁琐，结果分析间隔时间长，而且对于不同时期的初期癌症检测效果存在不确定性。本专利技术采用常见的生化试剂dUDP和BstDN本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用二磷酸尿嘧啶脱氧核苷酸识别带有N

【技术特征摘要】
1.一种利用二磷酸尿嘧啶脱氧核苷酸识别带有N6-甲基腺嘌呤的核酸的方法，其特征在于，具体包括：(1)以二磷酸尿嘧啶脱氧核苷酸(dUDP)作为DNA合成的原料，在紧邻疑为N6-甲基腺嘌呤的位点上游根据模板链序列设计一条长度为17-20bp的引物，在DNA聚合酶或逆转录酶作用下与核酸共孵育进行延伸反应，以将二磷酸尿嘧啶脱氧核苷酸(dUDP)掺入序列，所述核酸为疑为含N6-甲基腺嘌呤的位点的待测核酸或对照核酸，所述对照核酸为对应位点不含N6-甲基腺嘌呤、序列与待测核酸相近且其他位点含N6-甲基腺嘌呤水平与待测核酸相同的核酸；(2)步骤(1)的延伸产物通过变性聚丙烯酰胺凝胶分析，经凝胶成像仪测...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵轩，田沺，王少儒，宋燕燕，李惠，蒋尚文，王天洋，万泽中，张楠，范若晨，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42