一种日本血吸虫RPA分子检测方法技术

本发明专利技术公开了一种日本血吸虫RPA分子检测方法，它包括以下步骤：1)根据日本血吸虫SjCHGCS19基因的序列设计一对特异性引物及一条探针，所述日本血吸虫SjCHGCS19基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；2)提取待测样品中的总DNA，进行重组酶聚合酶等温扩增反应；3)对扩增产物进行检测。本发明专利技术对日本血吸虫的检测具有很高的特异性和敏感性，能在动物感染后的很短时间内通过采样粪便或全血检测出日本血吸虫，因此有利于实现日本血吸虫病的早期诊断和预警以及实验室早期鉴定和筛查。

A Molecular Detection Method for RPA of Schistosoma japonicum

【技术实现步骤摘要】
一种日本血吸虫RPA分子检测方法
本专利技术属于寄生虫分子检测
，具体涉及一种日本血吸虫的重组酶聚合酶等温扩增(RPA)检测方法。技术背景日本血吸虫是人畜共患的寄生性扁形异体吸虫，日本血吸虫具有复杂的生活史，广泛分布的中间宿主以及多种传播或保虫宿主，严重危害全球人畜健康并影响着各国畜牧业发展，是我国长期重点防治的五大寄生虫病之一。日本血吸虫的病变机理尚未完全了解，但已有研究发现虫卵沉积、虫体刺激、毛蚴腺体分泌的蛋白抗原等致病因素都可以引发寄生部位的各种病灶(GarciaEG,MitchellGF,RiveraPT,EvardomeRR,AlmonteRE,TiuWU.Evidenceofanti-embryonationimmunityandeggdestructioninmicesensitizedwithimmatureeggsofSchistosomajaponicum.AsianPacificJournalofAllergy&Immunology,1987,5:137)。核酸扩增是遗传信息分析实验中的基础步骤，聚合酶链式反应(PCR)扩增技术在病原鉴定、基因突变以及遗传分析等方面的应用中展现出优秀的检测性能，但存在着一定的局限性，其反应需要温控设备进行变性退火步骤，RNA样品需进行逆转录等复杂的处理以及需要专业技术人员操作等，因此难以广泛应用于现场快速检测。重组酶聚合酶扩增技术(RPA)是一种新型的核酸检测技术，它的原理是模拟T4噬菌体的体内核酸复制机制，室温条件下短时间内就可以将目标基因扩增到可检测的水平，该方法突破了PCR检测技术的局限性，摆脱了技术人员的限制和操作环境的高需求，可以一步实现对于病原的检测。因此，RPA非常适用于疫病的现场快速检测，拥有良好的应用前景。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种非诊断目的检测日本血吸虫的重组酶聚合酶等温扩增(RPA)方法，该方法具有高效、特异、灵敏、操作简便等优点。为了达到上述目的，本专利技术采取以下技术措施：一种日本血吸虫的重组酶聚合酶等温扩增分子检测方法，该方法包括以下步骤：首先是根据已报道的登录号为FN356221.1的日本血吸虫SjCHGCS19基因序列(见SEQIDNO：1)，设计特异性引物和探针：RPA-F1:5'-CATCGACTATGAGAAGGCGTTTGACAGCGTAG-3'RPA-R1:5'-CTTGGAGGAAGAGGATAGGAGAGAGCAGACAGC-3'RPA-NFO探针P：5'-AATTCTTACGACGGACTACAGTGCAAAATCGTGCATGGAGGACAGCTGAC-3'。然后进行重组酶聚合酶等温扩增反应，具体步骤包括：1.样品总DNA提取；2.重组酶聚合酶的等温扩增：(1)建立重组酶聚合酶的等温扩增(RPA)反应体系：2.1μL引物RPA-F1(10μM)，2.1μL引物RPA-R1(10μM)，0.6μLRPA-NFO探针P(10μM)，RehydrationBuffer29.5μL，1μLDNA模板，灭菌双蒸水12.2μL。(2)重组酶聚合酶的等温扩增反应：将步骤(1)总体积为47.5μL的溶液混匀，对每个样品的反应溶液转移到反应冻干颗粒(nfo试剂盒提供)中，用吸管上下混合直到全部颗粒被充分悬浮，然后加入2.5μL280mM的乙酸镁，然后大力正反旋转8-10次后，再次上下旋转混匀，使乙酸镁进入反应溶液引发反应。具体反应程序为：将反应管插放入到一个合适的加热器，39℃，反应4min，然后取出加热器中的样品，大力旋转8-10次，涡旋，旋转，再次把样品重放回加热器中，继续加热反应，时间为16min。最后对扩增产物进行分析：本专利技术采用MileniaGenlineHybridetect-1试纸条或者琼脂糖凝胶电泳(AGE)检测扩增产物，具体方法如下：采用MileniaGenlineHybridetect-1试纸条检测扩增产物：进行污染防控措施后，移2μL的扩增反应产物和98μLPBST缓冲液进行混合稀释，转移10μL稀释后的扩增产物进入hybridetect-1试纸条的样品垫区域，将试纸条的样品垫末端放进200μL的PBST缓冲液中，确认试纸条运作正常，2-5min后，若有扩增产物存在则逐渐形成两条紫色的条带，离样品垫近的一条紫色条带为测试带，较远的一条为参考线，若无目的产物生成则只出现单一的参考线。采用琼脂糖凝胶电泳(AGE)来检测扩增产物：按照商业PCR纯化试剂盒的说明书纯化扩增产物。所需的扩增产物的量，为可以通过一块合适的琼脂糖凝胶上电泳，然后按照标准说明和相应的方法进行，这些操作的进行非常类似于AGE分析PCR扩增产物。本专利技术所建立的日本血吸虫重组酶聚合酶等温扩增方法是一种简单实用的分子生物学检测方法，该方法与传统PCR方法相比较具有以下优点：1.重组酶聚合酶等温扩增不需要多个引物，不需要特殊的试剂和仪器，无需预变性而且扩增温度范围大，常用温度范围(25-42℃)与室温相近，反应时间也比其它扩增方法短，减少了退火变性步骤，一般在10-20min就能完成扩增，反应条件易满足，便于操作，非常适用于疫病的现场快速检测。2.本专利技术对日本血吸虫的检测具有很高的特异性和敏感性，能将日本血吸虫从蛇形毛圆线虫、捻转血矛线虫、肝片吸虫等多种寄生虫中鉴别出来，并且将DNA稀释到10-10(约100ag/ul)时仍能检测到目的片段，敏感性是PCR方法的105倍。3.本专利技术能在动物感染后的很短时间内通过采样粪便或全血检测出日本血吸虫，而常规的PCR方法检测周期更长且不适合检测全血样品，因此本专利技术方法既有利于实现日本血吸虫病的早期诊断和预警，又有利于实现日本血吸虫非诊断目的的实验室早期鉴定和筛查。4.利用本专利技术评价日本血吸虫病患兔的治疗效果：用吡喹酮治疗患兔后检测粪便样品，PCR和RPA方法检测重感染度的粪便样品分别在2周、10周转为阴性；轻感染度的粪便样品检测分别在3周、8周转为阴性。RPA对全血样品的检测：重感染度全血样品在16周转为阴性，轻感染度全血样品在15周转为阴性。因此，RPA方法对于日本血吸虫病的疗效考评明显优于PCR方法，在临床应用中具有极大的发展潜能。5.本专利技术扩增产物检测方式的多样化，RPA既可以通过凝胶电泳检测、也可以采用荧光技术对整个过程进行实时监控(例如：RT-RPA)，还可以通过侧流层试纸条直接可视化读取结果(如LFD-RPA)以及常规的凝胶电泳检测等。附图说明图1：日本血吸虫成虫的RPA扩增产物检测结果。图2：RPA方法对日本血吸虫检测的特异性试验结果。图3：PCR方法的敏感性试验结果。M为DNA分子量标准；1-10分别为日本血吸虫DNA浓度依次倍比稀释到10-1-10-10的PCR扩增产物检测结果。图4：RPA方法的敏感性试验结果。0为空白对照；1-11分别日本血吸虫DNA浓度依次倍比稀释到10-1-10-11的RPA扩增产物检测结果。图5：RPA方法对重感染度日本血吸虫病的家兔粪便早期诊断结果。N为阴性对照；P为阳性对照；1-10分别为家兔重度感染日本血吸虫1d、3d、5d、7d、10d、14d、21d、28d、35d、42d的粪便样品。图6：RPA方法对轻感染度本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种日本血吸虫RPA分子检测方法，其特征在于包括以下步骤：1)根据日本血吸虫SjCHGCS19基因的序列设计一对特异性引物及一条探针，所述引物对及探针的序列如下：RPA‑F1:5'‑CATCGACTATGAGAAGGCGTTTGACAGCGTAG‑3'RPA‑R1:5'‑CTTGGAGGAAGAGGATAGGAGAGAGCAGACAGC‑3'RPA‑NFO探针P：5'‑AATTCTTACGACGGACTACAGTGCAAAATCGTGCATGGAGGACAGCTGAC‑3'；2)提取待测样品中的总DNA，进行重组酶聚合酶等温扩增反应；3)对扩增产物进行检测，所述日本血吸虫SjCHGCS19基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

【技术特征摘要】
1.一种日本血吸虫RPA分子检测方法，其特征在于包括以下步骤：1)根据日本血吸虫SjCHGCS19基因的序列设计一对特异性引物及一条探针，所述引物对及探针的序列如下：RPA-F1:5'-CATCGACTATGAGAAGGCGTTTGACAGCGTAG-3'RPA-R1:5'-CTTGGAGGAAGAGGATAGGAGAGAGCAGACAGC-3'RPA-NFO探针P：5'-AATTCTTACGACGGACTACAGTGCAAAATCGTGCATGGAGGACAGCTGAC-3'；2)提取待测样品中的总DNA，进行重组酶聚合酶等温扩增反应；3)对扩增产物进行检测，所述日本...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡敏，朱涛，杨新，李雪松，米坤，刘璐，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42