基于Toehold介导链置换反应引发滚环扩增和FRET检测miRNA的方法技术

本公开提供了基于Toehold介导链置换反应引发滚环扩增和FRET检测miRNA的方法，该方法利用toehold介导的链置换反应引发待测miRNA进行滚环扩增反应，利用滚环扩增反应的DNA单链、含有供体荧光基团的DNA单链探针和含有受体荧光基团的DNA单链探针实现荧光共振能量转移的检测。本公开由于采用将TMSD与滚环扩增结合产生的DNA单链能够使使荧光团大量聚集，使得供体荧光基团的荧光强度不仅不会产生衰弱，而且产生了逐渐增强的趋势，从而提高了对于分析待测靶标miRNA的含量的效果。

Rolling Ring Amplification and Detection of MicroRNAs by FRET Based on Toehold Mediated Chain Displacement Reaction

【技术实现步骤摘要】
基于Toehold介导链置换反应引发滚环扩增和FRET检测miRNA的方法
本公开属于分子检测领域，涉及基于Toehold介导链置换反应引发滚环扩增和FRET检测miRNA的方法。
技术介绍
这里的陈述仅提供与本专利技术有关的背景信息，而不必然构成现有技术。MicroRNAs(miRNAs)是一类由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子，具有在翻译水平或转录后水平调控基因表达的功能。miRNAs的表达异常与多种疾病相关，如癌症、代谢性疾病等。因此miRNAs已经成为重要的早期临床诊断标志物。据本公开专利技术人所知，目前，定性检测RNA含量的方法主要是聚合酶链反应法(PCR)，检测方法较为单一。Toehold介导的链置换反应(TMSD)是一种不依赖于酶的由DNA的生物物理学特性驱动的化学反应。随着研究者对TMSD的不断深入，发现它不仅可以作为DNA纳米材料的组装基元，还可以作为生物分子识别元件。与简单的Watson-Crick碱基配对相比，TMSD可以提高核酸识别的特异性。利用TMSD可以实现对miRNA等核酸及小分子物质进行特异性和灵敏检测。然而，本公开专利技术人发现，TMSD具有信号输出较低的缺陷，该缺陷不利于将TMSD应用于检测miRNA。
技术实现思路
为了解决现有技术的不足，本公开先将TMSD与滚环扩增(RCA)结合，然后再采用荧光共振能量转移(FRET)进行检测，不仅可以提高识别miRNA的特异性，还可以放大信号来克服单纯TMSD的缺点。在滚环扩增的产物上连接能够产生FRET的两条荧光探针，可以实现对miRNA的定性检测。可应用于定性检测细胞中的目标miRNA，并分析该目标miRNA的生理功能。为了实现上述目的，本公开的技术方案为：一方面，一种miRNA的检测方法，利用toehold介导的链置换(TMSD)反应引发待测miRNA进行滚环扩增反应，利用滚环扩增反应的DNA单链、含有供体荧光基团的DNA单链探针和含有受体荧光基团的DNA单链探针实现荧光共振能量转移的检测。荧光共振能量转移的过程为：当一个荧光分子(又称为供体荧光分子)的荧光光谱与另一个荧光分子(又称为受体荧光分子)的激发光谱相重叠时，供体荧光分子的激发能诱发受体分子发出荧光，同时供体荧光分子自身的荧光强度衰减。本公开将先将TMSD与滚环扩增(RCA)结合，然后再与荧光共振能量转移(FRET)结合，发现本公开由于采用将TMSD与滚环扩增(RCA)结合产生的DNA单链能够使使荧光团大量聚集，使得供体荧光基团的荧光强度不仅不会产生衰弱，而且产生了逐渐增强的趋势，从而提高了对于分析待测靶标miRNA的含量的效果。为了便于上述检测方法的实现，另一方面，一种基于Toehold介导链置换反应引发滚环扩增和FRET检测miRNA的引物组，包括哑铃型DNA探针、含有供体荧光基团的DNA单链探针、含有受体荧光基团的DNA单链探针；所述哑铃型DNA探针为5'端和3'端连接的封闭的单链DNA形成的茎环结构，且所述茎环结构中茎的两端均有一个环，其中一个环含有toehold序列，toehold序列与茎的一条单链直接连接，所述茎的一条单链的序列与toehold序列构成的整体序列能够和待测miRNA配位；含有供体荧光基团的DNA单链探针和含有受体荧光基团的DNA单链探针均能够与引发待测miRNA滚环扩增反应形成的DNA单链进行配位，使配位后的供体荧光基团和受体荧光基团产生荧光共振能量转移。本公开中，由于toehold序列能够与一部分待测miRNA配位，促进哑铃型探针的茎双链序列打开，并使茎的一条单链与另一部分待测miRNA配位，从而使得哑铃型探针形成环状结构，进而能够实现滚环扩增，滚环扩增后的DNA单链能够与含有供体荧光基团的DNA单链、含有受体荧光基团的DNA单链进行配位，导致荧光基团大量聚集，使得供体荧光团的荧光强度既受荧光聚集效应的影响又受FRET效果的影响，因此产生逐渐增强的趋势。第三方面，一种miRNA的检测试剂盒，包括上述引物组、DNA聚合酶、DNA聚合酶反应缓冲液、BSA、dNTPs。第四方面，基于Toehold介导链置换反应引发滚环扩增和FRET检测miRNA的方法，采用上述引物组或试剂盒，其过程包括：先向待测中添加哑铃型DNA探针、DNA聚合酶、DNA聚合酶反应缓冲液、dNTPs和水加热至体温下进行反应，反应终止；再添加含有供体荧光基团的DNA单链探针和含有受体荧光基团的DNA单链探针进行反应；然后进行荧光检测。本公开的有益效果为：1)本公开通过利用TMSD的精准序列识别，实现了不依赖于酶的对miRNA的特异性识别，具有很好的选择性。2)本公开利用TMSD反应引发待测miRNA进行RCA反应可以将检测信号放大，使在检测低浓度的miRNA时可以很容易的收集检测信号。3)通常情况下，收集FRET荧光信号时，供体荧光团的荧光强度会随着反应物浓度的升高而衰减，受体荧光团的荧光强度随反应物浓度的升高而逐渐增强。而本公开中，由于TMSD反应引发RCA的产物使荧光团大量聚集，使得供体荧光团的荧光强度既受荧光聚集效应的影响又受FRET效果的影响，因此产生逐渐增强的趋势；本公开综合荧光聚集效应与FRET的效果，可以更好的分析待测靶标miRNA的含量。附图说明构成本公开的一部分的说明书附图用来提供对本公开的进一步理解，本公开的示意性实施例及其说明用于解释本公开，并不构成对本公开的不当限定。图1为实施例的原理图；图2为实施例中哑铃型DNA探针的选择表征图，A为520nm处荧光强度输出图，激发波长为494nm，B为TIRCA产物荧光增强倍数柱状图，ΔFa、ΔFb分别是当miR494和M1存在时与背景F0相比的荧光强度变化柱状图，C为ΔFa/ΔFa、ΔFb/ΔFa的柱状图；图3为实施例中在120分钟内实时荧光监测mir494、M1、M2分别与T8哑铃型DNA探针进行TIRCA反应的过程中激发波长为494nm、以1分钟的间隔记录521nm处的荧光强度曲线；图4为实施例中T8哑铃型DNA探针灵敏度分析图，分别在mir494为0、400pM、600pM、800pM、1nM、1.2nM的浓度下进行TIRCA的荧光发射光谱，其中，激发波长为494nm；图5为利用TIRCA与FRET结合的方法体外定性分析miRNA的表征图，A为miR494的浓度分别为0、400pM、1.2nM、2nM时的荧光光谱，激发波长为495nm时，从505nm记录到620nm的荧光曲线，激发波长为560nm时，收集从505nm到620nm的荧光曲线，B为在miR494的浓度为400pM、1.2nM、2nM时，在520nm处FAM的荧光增强倍数(△F)输出图，C为在miR494的浓度为400pM、1.2nM、2nM时，FRET的效率(△Fb/△Fc)趋势图，△Fb表示494nm激发波长下，在580nm处TAMRA的荧光增强倍数，△Fc表示560nm激发波长下，在580nm处TAMRA的荧光增强倍数；图6为实施例中分析检测细胞破碎液中的靶标miRNA的荧光光谱图，A为脐静脉细胞组的荧光光谱图，激发波长为495nm，从505nm到620nm记录荧光曲线；激发波长为560nm时收集的505nm到62本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种miRNA的检测方法，其特征是，利用toehold介导的链置换反应引发待测miRNA进行滚环扩增反应，利用滚环扩增反应的DNA单链、含有供体荧光基团的DNA单链探针和含有受体荧光基团的DNA单链探针实现荧光共振能量转移的检测。

【技术特征摘要】
1.一种miRNA的检测方法，其特征是，利用toehold介导的链置换反应引发待测miRNA进行滚环扩增反应，利用滚环扩增反应的DNA单链、含有供体荧光基团的DNA单链探针和含有受体荧光基团的DNA单链探针实现荧光共振能量转移的检测。2.一种基于Toehold介导链置换反应引发滚环扩增和FRET检测miRNA的引物组，其特征是，包括哑铃型DNA探针、含有供体荧光基团的DNA单链探针、含有受体荧光基团的DNA单链探针；所述哑铃型DNA探针为5'端和3'端连接的封闭的单链DNA形成的茎环结构，且所述茎环结构中茎的两端均有一个环，其中一个环含有toehold序列，toehold序列与茎的一条单链直接连接，所述茎的一条单链的序列与toehold序列构成的整体序列能够和待测miRNA配位；含有供体荧光基团的DNA单链探针和含有受体荧光基团的DNA单链探针均能够与引发待测miRNA滚环扩增反应形成的DNA单链进行配位，使配位后的供体荧光基团和受体荧光基团产生荧光共振能量转移。3.如权利要求2所述的引物组，其特征是，toehold序列长度为具有8个碱基的序列。4.如权利要求2所述的引物组，其特征是，所述供体荧光基团为羧基四甲基罗丹明，所述受体荧光基团为6-羧基荧光素。5.如权利要求2所述的引物组，其特征是，所述哑铃型DNA探针从5'端到3'端的DN...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐波，刘炬，王慧，李平，梁凯丽，
申请(专利权)人：山东师范大学，
类型：发明
国别省市：山东,37