一种常温核酸扩增反应制造技术

本发明专利技术提供了一种低温噬菌体蛋白在常温核酸扩增反应中的应用，其中低温噬菌体选自vB_EcoM‑VR5,vB_EcoM‑VR7 and vB_EcoM‑VR20,vB_EcoM‑VR25,vB_EcoM‑VR26，低温噬菌体蛋白为uvsX蛋白、uvsY蛋白和gp32蛋白和/或具有相应功能的突变体蛋白，优选情况下uvsX蛋白及其突变体蛋白选自SEQ ID No.1‑23、30任一条序列；uvsY蛋白及其突变体蛋白选自SEQ ID No.27‑29、32任一条序列；gp32蛋白及其突变体蛋白选自SEQ ID No.24‑26、31任一条序列。本发明专利技术还提供了包含低温噬菌体蛋白的常温核酸扩增反应体系。

A room temperature nucleic acid amplification reaction

【技术实现步骤摘要】
一种常温核酸扩增反应
本专利技术属于生物
，具体涉及一种具有低温活性的酶及其在低温体外条件下进行核酸扩增反应的应用。
技术介绍
体外核酸扩增技术在现代生命科学领域中是一项及其重要的
自1990年以来，体外核酸扩增
得到了飞速的发展，不仅如此，该
还将在未来的生命科学领域中扮演越来越重要的作用。人类和动物的很多疾病可以通过核酸技术进行早期诊断，而这依赖于一种有效的体外核酸扩增技术。聚合酶链式反应(Polymerasechainreaction,PCR)是一种经典的体外核酸扩增方法，从诞生到现在已经延用了30多年，并且基于PCR衍生出各种不同功能核酸检测方法，如RT-PCR(ReverseTranscript,反转录PCR)，qPCR(QuantitativePCR,荧光定量PCR)，巢式PCR等。PCR的反应需要在高温条件下将DNA双链裂解成单链，而后降温退火引物与模板链配对，最后在72℃条件下引物得到延伸，以上过程循环往复DNA呈指数式扩增。PCR的反应过程需要在具有精密温控元件的仪器中进行，这种仪器往往价格昂贵，同时对操作人员需要非常复杂的专业技能，因而只有在一些发达地区的实验室或者医疗机构才会配备，这大大限制了基于PCR的分子诊断技术推广应用。鉴于传统PCR受限于仪器设备和电力等因素的限制，近些年来恒温体外核酸扩增技术悄然兴起，如SDA(Stranddisplacementamplification,链置换扩增技术)，HDA(Helicasedependentamplification,解旋酶依赖性扩增技术)，NASBA(Nuclearacidsequence-basedamplification，核酸依赖性扩增检测技术)，LAMP(Loop-mediatedisothermalamplification,环介导等温扩增技术)，RCA(Rollingcircleamplification,滚环复制扩增技术),RPA(RecombinasePolymeraseAmplification,重组酶聚合酶扩增技术)等等[1]。其中应用最广泛的是LAMP和RPA，但是LAMP和RPA仍然需要在特定的温度下(LAMP：60-65℃，RPA：37-42℃)进行反应，而且其反应对温度的变化比较敏感，在非最适合温度下，其扩增效率会大大降低或者无法正确扩增。早期人们对DNA的体内复制进行了深入的研究，其中因T4噬菌体结构简单，侵入细菌后会将其基因组DNA在胞内能进行快速的复制，前人将其作为模式生物进行了大量的病毒学和分子遗传学研究。1976年YASUOIMAE等人利用噬菌体裂解液蛋白进行了T4噬菌体DNA的体外复制[29]；1979年，Sinha等又利用T4噬菌体复制相关蛋白(基因蛋白32,41,43,44,62,45,and61)实现了双链DNA的体外高效复制，DNA的延伸速度近乎可以达到与体内的500个碱基/秒的扩增效率[2]。gp32蛋白在T4噬菌体的DNA复制、重组和修复过程中起着关键作用，这其中最重要的是因为gp32蛋白具有紧密结合单链DNA的特性[3]。1983年，Formosa等将gp32蛋白固定在琼脂糖吸附柱上对T4噬菌体感染的细菌融菌产物进行亲和层析，发现T4噬菌体中的DNA聚合酶(gp43蛋白)和两种重要的重组通路蛋白(uvsX和uvsY蛋白)可以和gp32蛋白进行特异性结合[4]。uvsX蛋白在之后的研究中证实，它与大肠杆菌中的recA具有相似的功能，具有DNA依赖性ATP酶活性，可以在体外生理盐水条件下与单链或双链DNA结合，并催化其与同源的双链或单链DNA片段进行配对[5,6]。同期，Deborah等通过克隆重组表达了uvsX基因，并验证了uvsX蛋白在gp32蛋白存在下，具有ATP依赖性将单链置换双链DNA的活性，从而形成D-Loop结构，并将底物ATP分解为ADP和AMP两种产物[7A]。与recA不同的是，uvsX催化水解ATP的速率是recA的10-20倍，而且催化产物可以是AMP+PPi和ADP+Pi，水解ATP更彻底，而recA催化ATP只能产生ADP+Pi[7]。gp32蛋白可以大大刺激uvsX催化单链DNA(ssDNA)同源配对的活性，同时uvsX又可以与uvsY紧密结合[7]，而且uvsY可以通过加强uvsX与ssDNA的亲和力来提高uvsX的单链DNA依赖性ATP酶活性[8，9]。由uvsX结合ssDNA后进行的同源重组功能与T4DNA的复制过程紧密关联，uvsX-ssDNA与同源片段结合后，ssDNA可以作为一个引物进行DNA复制[10]。以上的证据表明，gp32、uvsX和uvsY蛋白在T4噬菌体DNA的复制过程中起到非常重要的作用。之后的研究中发现，uvsY与ssDNA形成的uvsY-ssDNA复合体可以引起ssDNA结构的改变，使ssDNA构架更加倾向于形成uvsX-SSDNA复合体，同时ATP的结合更加稳定了uvsX-ssDNA的结构[11-14]。进一步的研究发现，gp32蛋白与单链ssDNA形成稳定的gp32-ssDNA复合体，但是在uvsY的作用下，gp32-ssDNA复合体结构的稳定性明显减弱，同时使ssDNA更加倾向于形成uvsX-ssDNA复合体[15]。DavidA.Zarling等人利用这一特征，通过大肠杆菌RecA蛋白和SSB蛋白，利用特异性引物进行了特定区段的核酸扩增；Piepenburg在此基础上又做了改进，并将大肠杆菌蛋白替换为T4噬菌体蛋白gp32、uvsX、uvsY，DNA聚合酶选用bsuDNA聚合酶大片段或sauDNA聚合酶大片段，并命名为RPA扩增(recombinasepolymeraseamplification)[22]。Gp32蛋白功能类似于细菌中的SSB蛋白，它可以特异性与ssDNA寡核苷酸引物，就形成Gp32-引物复合物，使引物保持单链结构；第二步，UvsY与Gp32-引物复合物形成UvsY-Gp32-引物复合物，并降低Gp32与引物结合的亲和力，从而使UvsX竞争性的与引物结合形成UvsX-引物复合物；第三步，UvsX-引物复合物在ATP的作用下具有与模板链中互补位点同源配对的特性，并置换出碱基序列相同的链，而后与互补链结合形成D-loop结构；第四步D-loop结构中引物暴露的3’端在DNA聚合酶的作用下引物得到延伸，直至复制完成。以上过程循环往复靶DNA片段就可呈指数式扩增。尽管据报道RPA技术可以在30度条件下能够扩增，但其扩增效率大大降低，为了进一步降低反应温度，本专利通过针对Gp32、UvsX和UvsY，DNA聚合酶，肌酸激酶等蛋白进行体外组合筛选低温噬菌体蛋白或进行氨基酸突变筛选，使扩增反应可以在更低的温度下以指数式速率高效扩增，缩短扩增时间。这样甚至可以彻底脱离温控设备，只需要一般室内环境温度即可进行快速扩增；结合核酸检测方法，使整个核酸扩增和检测所需的设备更加简化，操作更加便捷；对于反应的可以选用的介质范围更加广泛，扩增反应可以不局限于加热的介质上进行,如纤维纸片,尼龙膜,硝酸纤维素膜,棉纤维球等。
技术实现思路
大约90％已知的T4相关的噬菌体的宿主为大肠杆菌或其它肠本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.低温噬菌体蛋白在常温核酸扩增反应中的应用，其特征在于低温噬菌体蛋白为uvsX蛋白、uvsY蛋白和gp32蛋白和/或分别与低温噬菌体uvsX蛋白、低温噬菌体uvsY蛋白、低温噬菌体gp32蛋白具有相同功能的突变体蛋白，优选情况下低温噬菌体uvsX蛋白选自SEQ ID No.21‑23、30任一条序列或与上述序列具有98％及以上同源性的序列，uvsX突变体蛋白选自SEQ ID No.1‑20任一条序列或与上述序列具有98％及以上同源性的序列；低温噬菌体uvsY蛋白选自SEQ ID No.27‑29、32任一条序列或与上述序列具有98％及以上同源性的序列；低温噬菌体gp32蛋白选自SEQ ID No.24‑26、31任一条序列或与上述序列具有98％及以上同源性的序列。

【技术特征摘要】
1.低温噬菌体蛋白在常温核酸扩增反应中的应用，其特征在于低温噬菌体蛋白为uvsX蛋白、uvsY蛋白和gp32蛋白和/或分别与低温噬菌体uvsX蛋白、低温噬菌体uvsY蛋白、低温噬菌体gp32蛋白具有相同功能的突变体蛋白，优选情况下低温噬菌体uvsX蛋白选自SEQIDNo.21-23、30任一条序列或与上述序列具有98％及以上同源性的序列，uvsX突变体蛋白选自SEQIDNo.1-20任一条序列或与上述序列具有98％及以上同源性的序列；低温噬菌体uvsY蛋白选自SEQIDNo.27-29、32任一条序列或与上述序列具有98％及以上同源性的序列；低温噬菌体gp32蛋白选自SEQIDNo.24-26、31任一条序列或与上述序列具有98％及以上同源性的序列。2.一种包含低温噬菌体蛋白的常温核酸扩增反应体系，包括引物对和待检测模板、重组酶，聚合酶，单链DNA结合蛋白，核酸酶，dNTP、拥挤试剂、重组加载蛋白、能量系统和盐离子；所述重组酶优选为低温噬菌体UvsX蛋白、与低温噬菌体uvsX蛋白具有相同功能的突变体或其组合；所述聚合酶选自大肠杆菌klenow聚合酶大片段(exo-)，金黄色葡萄球菌聚合酶I大片段(exo-)，枯草芽孢杆菌聚合酶I大片段(exo-)，荧光假单胞杆菌聚合酶I大片断(exo-)及其这些酶的突变体或大片段的任一种或一种以上的组合；所述单链DNA结合蛋白选自低温噬菌体gp32蛋白、与低温噬菌体gp32蛋白具有相同功能的突变体或其组合；所述核酸酶选自核酸外切酶III，核酸内切酶IV；所述重组加载蛋白选自低温噬菌体UvsY蛋白、与低温噬菌体UvsY蛋白具有相同功能的的突变体或其组合；所述拥挤...

【专利技术属性】
技术研发人员：于继彬，李俊，马陈翠，高山珊，
申请(专利权)人：苏州先达基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32