用于核酸恒温扩增反应的冻干辅助试剂制造技术

本发明专利技术公开了用于核酸恒温扩增反应的冻干辅助试剂，所述冻干辅助试剂为包含缓冲液或保护成分

【技术实现步骤摘要】
用于核酸恒温扩增反应的冻干辅助试剂、试剂盒及使用方法


[0001]本专利技术属于分子生物学领域，具体涉及应用于恒温扩增体系下冻干辅助试剂
、
试剂盒及使用方法
。

技术介绍

[0002]近几年来，随着生物技术的飞速发展，核酸检测在临床诊断和动物疾病诊断等方面得到了广泛应用，恒温扩增技术也在此背景下出现
。
恒温扩增技术是指一种在恒温条件下即可实现快速
、
高效地获取大量核酸的方法
。
恒温扩增技术包括滚环核酸扩增
(rolling circle amolification
，
RCA)、
环介导等温扩增
(loop
‑
mediated isothermal amplification
，
LAMP)、
重组酶聚合酶扩增技术
(recombinase polymerase amplification
，
RPA)、
链替代扩增
(strand displacement amplification
，
SDA)、
依赖核酸序列扩增
(nucleic acid sequence based amplification
，
NASBA)
和解链酶扩增
(helix dependent amplification
，
HAD)
等等
【Yan L,Zhou J,Zheng Y,et al.Isothermal amplified detection of DNA and RNA[J]Molec
μ
lar Biosystems,2014,10(5):970
‑
1003.】。
该技术与传统的
PCR
相比有着高效
、
快速且不用专用设备等优点，已经运用到多个领域，特别是应用于微生物病原菌检测，例如非洲猪瘟病毒
、2019
‑
nCOV
检测等领域
【Cord C Uphoff,Hans G Drexler.,Detection of Mycoplasma contamination in cell cultures[J]Current Protocols in Molec
μ
lar Biology,2014,28.4.1
‑
28.4.14】。
当前
。
[0003]恒温扩增技术用到的试剂包括各种酶
、
缓冲液
、
盐离子
、
寡核苷酸等成分，为保护这些成分的活性及效果，需要在低温条件下储存
、
运输，成本较高，且需反复冻融降低了生物活性
。

技术实现思路

[0004]为了解决上述问题，本专利技术提供了用于核酸恒温扩增反应的冻干辅助试剂
、
试剂盒及使用方法
。
[0005]传统的核酸检测试剂，如
PCR
检测试剂，也存在低温运输及反复冻融问题
。
因此，市面上存在冻干检测试剂盒，该试剂盒中包含冻干的酶以及液体形式的其余组分
。
然而，恒温扩增技术用到的是多种衡量成分的混合体系，只将其中的一种或一部分组分进行冻干处理，剩余部分不进行冻干处理，或者将多种组分分开进行冻干处理，其产生的误差会影响后续的实验，使实验的重复性无法得到保障，其未冻干的液体部分仍需要考虑低温储存
、
运输问题
。
[0006]一方面，本专利技术提供了用于核酸恒温扩增反应的冻干辅助试剂
。
[0007]该冻干辅助试剂由包含缓冲液或保护成分
、
核酸扩增原料
、
激活盐
、
冻干赋形剂或冻干保护剂的混合溶液冻干而成
。
[0008]在一些方式中，所述冻干赋形剂或冻干保护剂包括以下一种或多种：
[0009](1)
糖醇类：海藻糖
、
棉籽糖
、
葡聚糖
、
糊精
、
聚乙二醇
、
甘露醇
、
甘油；
[0010](2)
氨基酸或蛋白质类：丙氨酸
、
赖氨酸
、
谷氨酸钠
、
牛血清蛋白
、
酪蛋白；
[0011](3)
表面活性剂：曲拉通
X
‑
100、
吐温
‑
80、
乙基苯基聚乙二醇
‑
40
；
[0012](4)
无水溶剂：二甲基亚砜
(DMSO)、N,N
‑
二甲基甲酰胺
(DMF)。
[0013]优选地，所述冻干赋形剂或冻干保护剂由海藻糖
、
棉籽糖和甘露醇组成
。
[0014]优选地，混合溶液中海藻糖
、
棉籽糖和甘露醇的质量百分比分别为
5.0
％～
10.0
％
、1.0
％～
6.0
％和
1.0
％～
10.0
％
。
[0015]优选地，混合溶液中海藻糖
、
棉籽糖和甘露醇的质量百分比分别为
6.0
％～
7.0
％
、1.5
％～
3.0
％和
1.0
％～
3.0
％
。
[0016]优选地，海藻糖
、
棉籽糖和甘露醇的质量百分比分别为
6.5
％
、2.0
％和
2.0
％
。
[0017]进一步地，专利技术人对具体的冻干条件进行了优化，发现将所述辅助试剂的混合溶液以液滴的形式滴入液氮，可快速凝固成固体小球，再于冻干机中冻干，可进一步减小冻干损失
。
此外，恒温扩增反应体系的总体积微小，一滴混合溶液正好为一份恒温扩增反应辅助试剂的量
。
[0018]具体地，所述混合溶液的冻干包括以下步骤：
[0019]S1
将所述混合溶液滴入液氮中，液滴在液氮中迅速凝固成小球；
[0020]S2
将步骤
S1
的小球置于冻干机中冻干
。
[0021]在一些方式中，所述液滴的体积在
200
μ
l
及以下，优选
10
～
100
μ
l。
[0022]与将混合溶液直接放入冻干机冻干相比，将固体小球本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
用于核酸恒温扩增反应的冻干辅助试剂，其特征在于，所述冻干辅助试剂由包含缓冲液或保护成分
、
核酸扩增原料
、
激活盐
、
冻干赋形剂或冻干保护剂的混合溶液冻干而成
。2.
如权利要求1所述的冻干辅助试剂，其特征在于，所述冻干赋形剂或冻干保护剂由海藻糖
、
棉子糖和甘油组成
。3.
如权利要求2所述的冻干辅助试剂，其特征在于，海藻糖
、
棉子糖和甘油占所述混合溶液的质量百分比分别为
6.0
％～
7.0
％
、1.5
％～
3.0
％和
1.0
％～
3.0
％
。4.
如权利要求2所述的冻干辅助试剂，其特征在于，海藻糖
、
棉子糖和甘油占所述混合溶液的质量百分比分别为
6.5
％
、2.0
％和
2.0
％
。5.
如权利要求1所述的冻干辅助试剂，其特征在于，所述混合溶液的冻干包括以下步骤：
S1
将所述混合溶液滴入液氮中，液滴在液氮中迅速凝固成小球；
S2
将步骤
S1
的小球放入冻干机中，冻干程序为：
‑
45℃
，0帕，1小时；
‑
40℃
，1帕，6小时；
‑
30℃
，1帕，
20
分钟；
‑
20℃
，1帕，
20
分钟；
‑
10℃
，1帕，
20
分钟；
0℃
，1帕，
90
分钟；
10℃
，1帕，
30
分钟；
20℃
，1帕，
30
分钟；
25℃
，1帕，1小时
。6.
如权利要求1所述的冻干辅助试剂，其特征在于，所述激活盐包括以下一种或多种盐离子：镁离子
、
镍离子
、
锰离子；所述核酸扩增原料包括以下一种或多种：上游引物
、
下游引物
、
内引物
、
外引物
、
探针
、
脱氧核糖核苷酸
、
核糖核苷酸；所述缓冲液或保护成分...

【专利技术属性】
技术研发人员：王剑锋，陈文柱，崔菘，姚永豪，于继彬，
申请(专利权)人：苏州先达基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：