基于制造技术

本发明专利技术属于电化学生物传感器领域，涉及

【技术实现步骤摘要】
基于DNA walker与SDR的CYFRA21
‑
1无酶级联扩增检测方法和应用


[0001]本专利技术属于电化学生物传感器领域，涉及
CYFRA21
‑1的灵敏检测，特别是基于
DNA walker
与
SDR
的
CYFRA21
‑1无酶级联扩增检测方法和应用
。

技术介绍

[0002]肺癌是一种严重威胁人类健康和生命的恶性肿瘤，主要分为小细胞肺癌
(SCLC)
和非小细胞肺癌
(NSCLC)
，其中非小细胞肺癌占比较高，约为
80%
ꢀ‑ꢀ
85%。
细胞角蛋白片段抗原
21
‑
1 (CYFRA21
‑
1) DNA
被认为是一种主要用于诊断非小细胞肺癌的肿瘤标志物，其在血清中的水平与肿瘤的临床分期呈正相关，也可作为肺癌手术及放化疗后追踪早期复发的有效指标
。
因此，在基因水平上实现对
CYFRA21
‑1的检测对于早期肺癌诊断及预后具有重要意义
。
[0003]迄今为止，研究者们已经探索出癌症生物标志物的多种检测方法，如荧光分析法
、
表面等离子体共振
、
酶联免疫分析（专利
CN102426245A
）与电化学方法等
。
专利
CN108445213A
中还公开了一种高灵敏度荧光定量检测血清肿瘤标志物的试剂盒，该试剂盒以金纳米粒子为载体，先将
DNA
酶链修饰在金纳米粒子表面，得到金纳米粒子
‑
酶链；再将待检测血清肿瘤标志物二抗修饰在所述金纳米粒子
‑
酶链上，用于检测各种血清肿瘤标志物，该试剂盒的检测限为
ng
级别，灵敏度有待进一步提高
。
电化学检测由于操作简单
、
响应迅速
、
灵敏度高而表现出一定的优越性
。
然而，在肺癌早期，
CYFRA21
‑1在生物体内表达水平较低，导致疾病早期准确诊断较为困难
。
因此，亟需构建一种高效的电化学传感策略用于
CYFRA21
‑1的超灵敏检测
。
[0004]为实现超灵敏检测，提高电化学生物传感器的灵敏度，一系列生物放大技术被相继提出，如
HCR
（杂交链式反应）
、RCA
（滚环扩增）
、TMSDR
（
toehold
区域介导的链置换反应）
、DNA
步行器（
DNA Walker
）及酶辅助扩增等
。
[0005]TMSDR
是由
toehold
区域碱基互补配对驱动的一类特殊
SDR
反应
。
该反应在室温下由熵驱动自发产生而无需酶的参与，整个过程操作简单
、
灵敏度高，并且可以通过调节
Toehold
区域的碱基序列控制反应速率，具有对单碱基突变
DNA
选择性高
、
受环境影响小等特点
。
但在临床实际样品检测中不仅需要高特异性，还需要有高灵敏度
。
而传统的
Toehold
介导的链置换反应往往在电极表面进行，受空间位阻效应的影响往往所需反应时间较长且链置换效率低，输出
DNA
链与其他干扰链分离困难，进而导致分析性能不佳，灵敏度较差
。

技术实现思路

[0006]为解决上述技术问题，本专利技术提出一种基于
DNA walker
与
SDR
的
CYFRA21
‑1无酶级联扩增检测方法和应用，目的在于通过熵驱动的
DNA walker
与
TMSDR
结合实现目标物的循环利用和级联
TMSDR
，从而产生大量
SP
以提高传感方法的灵敏度，并通过磁分离技术排除均相体系中非靶向
DNA
链的干扰，进而实现对
CYFRA21
‑1的便捷快速灵敏检测
。
[0007]本专利技术的技术方案是这样实现的：基于
DNA walker
与
SDR
的
CYFRA21
‑1无酶级联扩增检测方法和应用，步骤如下：（1）分别配制底物链
T1/SP、
目标物
CYFRA21
‑
1、
燃料链
FW、
及发夹探针
HP
的缓冲溶液；（2）将表面羧基化的
MBs
溶液活化，经
PBS
洗涤后，向活化的
MBs
溶液中加入底物链
T1/SP
缓冲溶液，经振荡过夜反应后进行磁分离并反复洗涤，加入
PBS
重悬得
T1/SP/MBs
悬浮液；（3）向步骤（2）的
T1/SP/MBs
悬浮液中加入不同浓度的
CYFRA21
‑
1/
待测样品溶液与
FW
缓冲溶液，经恒温振荡反应后进行磁分离，取富含待测物
SP
的上清液待用，待测物
SP
含量与目标物
CYFRA21
‑1浓度呈正相关；（4）将金电极用新鲜配置的食人鱼溶液进行预处理，用不同粒径的氧化铝粉末对金电极进行抛光并超声清洗后，在
H2SO4溶液中进行电化学清洗与活化，然后滴加步骤（1）中发夹探针
HP
的缓冲溶液至电极表面，反应结束后用
MCH
封闭剂以封闭传感界面上的非特异性活性位点，将步骤（3）得到的待测物
SP
滴加至
HP
修饰的电极表面反应后，再进行电化学信号测定，通过检测不同浓度
CYFRA21
‑1经步骤（3）反应得到的待测物
SP
对应的
DPV
信号强度，建立浓度与峰值电流之间的线性关系方程式；（5）将步骤（4）中的待测物
SP
替换为步骤（3）的待测样品溶液反应所置换的待测物
SP
，测得的
DPV
信号强度代入步骤（4）的线性方程，即为待检测样品溶液中
CYFRA21
‑1的浓度
。
[0008]所述步骤（1）中底物链
T1/SP
中的
SP
的序列如
SEQ ID No.1
所示，其
5'
端与亚甲基蓝相连
、T1
碱基序列如
SEQ ID本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1. 基于
DNA walker
与
SDR
的
CYFRA21
‑1无酶级联扩增检测方法，其特征在于，步骤如下：（1）分别配制底物链
T1/SP、
燃料链
FW
及发夹探针
HP
的缓冲溶液；（2）向活化的
MBs
溶液中加入底物链
T1/SP
的缓冲溶液，经振荡过夜反应后进行磁分离并反复洗涤，再加入
PBS
重悬得
T1/SP/MBs
悬浮液；（3）向步骤（2）的
T1/SP/MBs
悬浮液中加入待测样品
、
燃料链
FW
的缓冲溶液，经恒温振荡反应后进行磁分离，取上清液作为样品检测液；（4）金电极经食人鱼溶液预处理后，用氧化铝浆液进行抛光并超声清洗，再在
H2SO4溶液中进行电化学清洗与活化，所得的金电极表面上滴加经
TCEP
还原的发夹探针
HP
的缓冲溶液，孵育后洗涤，再在
MCH
溶液中孵育得
HP
修饰的电极；（5）将步骤（3）的样品检测液滴加至步骤（4）
HP
修饰的电极表面进行反应，再进行电化学信号测定峰值电流，代入浓度与峰值电流之间的线性关系方程式即可检测待测样品中的
CYFRA21
‑
1。2. 根据权利要求1所述的基于
DNA walker
与
SDR
的
CYFRA21
‑1无酶级联扩增检测方法，其特征在于：所述步骤（1）中底物链
T1/SP
中的
SP
的碱基序列如
SEQ ID No.1
所示，其
5'
端与亚甲基蓝相连
、T1
碱基序列如
SEQ ID No.2
所示，其
3'
端与氨基相连；燃料链
FW
碱基序列如
SEQ ID No.4
所示；发夹探针
HP
碱基序列如
SEQ ID No.5
所示，其
3'
端与
‑
(CH2)6‑
SH
相连
。3. 根据权利要求2所述的基于
DNA walker
与
SDR
的
CYFRA21
‑1无酶级联扩增检测方法，其特征在于，所述底物链
T1/SP
的制备方法为：将
2 μ
M SP
的
Tris
‑
HCl
缓冲液与
T1
的
Tris
‑
HCl
缓冲液，以2：1的摩尔比于
50 μ
L Tris
‑
HCl
缓冲液中，
95 ℃
条件下退火
5 min<...

【专利技术属性】
技术研发人员：邹丽娜，郭佳欣，柳金枝，
申请(专利权)人：郑州大学，
类型：发明
国别省市：