一种基于制造技术

本发明专利技术公开了一种基于

【技术实现步骤摘要】
一种基于CRISPR
‑
Cas12a的猪肠道冠状病毒快速检测方法


[0001]本专利技术属于生物
，特别涉及一种基于
CRISPR
‑
Cas12a
的猪肠道冠状病毒快速检测方法
。

技术介绍

[0002]猪肠道冠状病毒是一类有囊膜包被的单股正链
RNA
病毒，目前已发现的猪肠道冠状病毒包括猪传染性胃肠炎病毒
(Transmissible gastroenteritis virus
，
TGEV)、
猪流行性腹泻病毒
(Porcine epidemic diarrhea virus
，
PEDV)、
猪德尔塔冠状病毒
(Porcine deltacoronavirus
，
PDCoV)
和猪急性腹泻综合征冠状病毒
(SwineAcute Diarrhea Syndrome Coronavirus
，
SADS
‑
CoV)。
猪肠道冠状病毒能引起猪胃肠道相关疾病，导致新生仔猪严重腹泻和高死亡率，给我国养猪业带来了严重的经济损失
。
引起猪腹泻的这四种冠状病毒结构相似，且造成的临床症状和病理特征很接近，仅靠肉眼很难判断由何种病毒感染，这增加了猪肠道冠状病毒的确诊和防控
。
目前有几种标准的检测方法如病毒分离
、
病毒中和实验等，这些方法实验周期长，不适合同时检测多个样品
。
聚合酶链反应
(PCR)
和实时荧光定量
PCR
虽然能大大缩短检测时间，但需要昂贵的仪器才能完成检测
。
[0003]由成簇的规律的间隔短回文重复序列
(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats
，
CRISPR)
和
CRISPR
相关蛋白
(CRISPR associated proteins
，
Cas)
组成的系统被称为
CRISPR
‑
Cas
系统
。
在过去的十年中，
CRISPR
‑
Cas
系统因其能非常有效
、
快速
、
简单和廉价地实现细胞敲除基因而引发了基因编辑革命
。CRISPR
‑
Cas
系统的免疫反应大致分为免疫获得
、
表达和免疫干预三个阶段
。
在免疫获得阶段，
Cas
蛋白检测外来核酸以获得新的间隔序列，并将其整合到自身
CRISPR
阵列中；第二阶段表达
CRISPR
阵列，转录
crRNA
前体
(pre
‑
crRNA)
，并加工为成熟的
crRNA
；在最后阶段，与侵入的核酸相对应的
crRNA
跟一种或多种
Cas
蛋白组装形成
crRNA
核糖核蛋白
(crRNP)
效应复合物，识别特定位点并对外来核酸进行切割
。
[0004]因此，一种快速
、
易操作
、CRISPR
‑
Cas12a
系统因其具有体外无差别地切割附近的非靶单链
DNA
的特性，近年来在体外诊断领域成为研究热点
。
但目前仍鲜有
CRISPR
‑
Cas12a
系统检测猪肠道冠状病毒的相关研究
。

技术实现思路

[0005]本专利技术的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种基于
CRISPR
‑
Cas12a
的猪肠道冠状病毒快速检测方法
。
[0006]本专利技术的另一目的在于提供一种基于
CRISPR
‑
Cas12a
的猪肠道冠状病毒快速检测试剂盒
。
[0007]本专利技术的目的通过下述技术方案实现：
[0008]一种非诊断目的的基于
CRISPR
‑
Cas12a
的猪肠道冠状病毒快速检测方法，包括以下步骤：
[0009]提取待检测样本的核酸，进行重组酶聚合酶等温扩增
(RT
‑
RPA)
反应；将
RT
‑
RPA
反应产物作为模板进行
CRISPR
‑
Cas12a
反应，判断荧光值是否大于等于阈值，若是，则为阳性，若否，则为阴性
。
[0010]进一步地，所述的检测样本为猪肠道组织或拭子样品；更进一步地，所述的拭子样品为肝拭子样品
。
[0011]进一步地，所述的提取待检测样本的核酸，包括以下步骤：
[0012](1)
样品预处理：
[0013]当样品为猪肠道组织时，用含青霉素和链霉素的
PBS
缓冲液冲洗观察选取肠壁变薄
、
有水样内容物的典型病变肠段，将其剪断后放入含青霉素和链霉素的
DMEM
培养基中，冷冻破碎，冷冻离心，取上清过滤除菌；
[0014]当样品为拭子样品时，加入
PBS
缓冲液混匀，离心，取上清液；
[0015](2)
将预处理后的样品使用
Magen
公司的病毒总核酸快速提取试剂盒
(RaPure Viral RNA/DNA Kit)
进行提取
。
[0016]进一步地，所述的
RT
‑
RPA
反应所用的引物对具体如下：
[0017]当检测猪流行性腹泻病毒
(PEDV)
时，引物对为：
[0018]PEDV
‑
F1
：
TGGTAATGTAAAACCCCAGAGAAAGAAGGAAA
；和
[0019]PEDV
‑
R1
：
ATTTCCTGTATCGAAGATCTCGTTGATAATTT
；
[0020]当检测猪急性腹泻综合征冠状病毒
(SADS
‑
CoV)
时，引物对为：
[0021]SADS
‑
CoV
‑
F3
：
ACACAAGCTGCACTAGCCTTTGGTAGTGAAAT
；和
[0022]SADS
‑
CoV
‑
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种非诊断目的的基于
CRISPR
‑
Cas12a
的猪肠道冠状病毒快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤：提取待检测样本的核酸，进行重组酶聚合酶等温扩增反应；将重组酶聚合酶等温扩增反应产物作为模板进行
CRISPR
‑
Cas12a
反应，判断荧光值是否大于阈值，若是，则为阳性，若否，则为阴性
。2.
根据权利要求1的猪肠道冠状病毒快速检测方法，其特征在于：所述的重组酶聚合酶等温扩增反应所用的引物对具体如下：当检测猪流行性腹泻病毒
(PEDV)
时，引物对为：
PEDV
‑
F1
：
TGGTAATGTAAAACCCCAGAGAAAGAAGGAAA
；和
PEDV
‑
R1
：
ATTTCCTGTATCGAAGATCTCGTTGATAATTT
；当检测猪急性腹泻综合征冠状病毒
(SADS
‑
CoV)
时，引物对为：
SADS
‑
CoV
‑
F3
：
ACACAAGCTGCACTAGCCTTTGGTAGTGAAAT
；和
SADS
‑
CoV
‑
R5
：
GAGTGAACACTGGGGCATCAGCATTTAGGTCT
；当检测猪德尔塔冠状病毒
(PDCoV)
时，引物对为：
PDCoV
‑
F5
：
GGGTATGGCTGATCCTCGCATCATGGCTCTA
；和
PDCoV
‑
R1
：
GCGCATCCTTAAGTCTCTCATAGTCAGGAGAA
；当检测猪传染性胃肠炎病毒
(TGEV)
时，引物对为：
TGEV
‑
F4
：
AACAAGCTGTTCTTGCCGCACTTAAAAAGTTA
；和
TGEV
‑
R4
：
TGTCACATCACCTTTACCTGCAGTTCTCTTCC。3.
根据权利要求1的猪肠道冠状病毒快速检测方法，其特征在于：所述的
CRISPR
‑
Cas12a
反应使用的
crRNA
具体如下：当检测
PEDV
时，
crRNA
为：
PEDVcrRNA3
：
UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUgaaugggacacagcuguugaugg
；当检测
SADS
‑
CoV
时，
crRNA
为：
SADS
‑
CoVcrRNA1
：
UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUgaguaagccgagacuugcucaag
；当检测
PDCoV
时，
crRNA
为：
PDCoVcrRNA3
：
UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUgcuggccaccuugagagcaacuu
；当检测
TGEV
时，
crRNA
为：
TGEVcrRNA3
：
UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUgaacgagagcguugcuguuguuu。4.
根据权利要求1的猪肠道冠状病毒快速检测方法，其特征在于：所述的
RT
‑
RPA
反应的反应体系为：
Buffer A、
浓度为
10
μ
M
的上游引物
、
浓度为
10
μ
M
的下游引物
、RNase
‑
Free Water、Buffer B
和待检测样本的
RNA
；所述的
Buffer A
和
BufferB
为安普未来公司的
RNA
快速恒温扩增试剂盒中的试剂；所述的
CRISPR
‑
Cas12a
反应的反应体系为：
NEBuffer 2.1、RNA
酶抑制剂
、
浓度为1μ
M
的
ssDNAreporter、crRNA、
浓度为
500nM
的
Cas12a
核酸酶
、
浓度为1μ
g/
μ
L
的
RT
‑
RPA
反应产物和
RNaseFreeWater。5.
根据权利要求1的猪肠道冠状病毒快速检测方法，其特征在于：所述的
RT
‑
RPA
反应的恒温反应温度为：
40
‑
45℃
；所述的
CRISPR
‑
Cas12a
反应在酶标仪中进行
。
6.
根据权利要求1的猪肠道冠状病毒快速检测方法，其特征在于：所述的荧光值为
CRISPR
‑
Cas12a
反应
15min
...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐志超，夏永波，曹永长，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：