含异二聚体抗体FC的蛋白及其制备方法技术

本文公开了新的含异二聚体抗体FC的蛋白(比如双特异性抗体)和用于制备此类蛋白的新方法。

Protein Containing Heterodimer Antibody FC and Its Preparation Method

【技术实现步骤摘要】
含异二聚体抗体FC的蛋白及其制备方法本申请是与母案专利技术名称相同的分案申请，母案的中国申请号是201180030540.9，国际申请号是PCT/EP2011/056388，申请日是2011年4月20日。专利
本专利技术涉及新的含异二聚体抗体Fc的蛋白比如双特异性抗体，及制备此类蛋白的新方法。专利技术背景近年来单克隆抗体已成为成功的治疗分子，特别是用于治疗癌症。但是，不幸的是，当单克隆抗体用作单一疗法时，经常不能治愈疾病。双特异性抗体有可能克服单克隆抗体疗法的一些限制，如它们可用作介质以靶向药物或毒性化合物至靶细胞，用作介质以再靶向效应机制至疾病相关部位或用作介质以增加对肿瘤细胞的特异性，例如通过与只见于肿瘤细胞的靶分子的组合结合。最近关于双特异性抗体的不同形式和用途的综述见于Chames和Baty(2009)CurrOpinDrugDiscDev12:276。开发双特异性抗体的主要障碍之一是通过传统技术难以制备足够质量和数量的材料，所述传统技术比如杂交杂交瘤和化学缀合方法(Marvin和Zhu(2005)ActaPharmacolSin26:649)。由不同重链和轻链组成的两种抗体在宿主细胞中的共表达，除了产生期望的双特异性抗体以外，还产生可能的抗体产物的混合物。已描述数种策略以利于在不同抗体构建体共表达后形成异二聚的(即双特异性)产物。Lindhofer等(1995JImmunol155:219)已描述产生不同抗体的大鼠和小鼠杂交瘤的融合导致功能性双特异性抗体的富集，因为优先的物种限制性重/轻链配对。另一种促使形成异二聚体超过同二聚体的策略是“进入孔中的隆突（knob-into-hole）”策略，其中在第一重链多肽的界面引入隆起，在第二重链多肽的界面引入对应的腔，使得隆起可位于腔内，以便促使异二聚体形成和阻碍同二聚体形成。“隆起”是通过用较大的侧链从第一多肽的界面置换小的氨基酸侧链而构建的。与隆起相同或相似大小的互补“腔”是通过用较小的氨基酸侧链置换大的氨基酸侧链而在第二多肽的界面建立的(US专利5,731,168)。EP1870459(Chugai)和WO2009089004(Amgen)描述了有利于在不同抗体域在宿主细胞中共表达后形成异二聚体的其它策略。在这些方法中，组成两个CH3域中的CH3-CH3界面的一个或更多个残基被荷电氨基酸置换，使得在静电上不利于形成同二聚体且在静电上利于异二聚体化。WO2007110205(Merck)描述又一种策略，其中利用IgA与IgGCH3域之间的差异促使异二聚体化。Dall’acqua等(1998Biochemistry37:9266)已鉴定五个参与CH3同二聚体界面中的CH3-CH3接触的在能量上关键的氨基酸残基(366、368、405、407和409)。WO2008119353(Genmab)描述用于制备双特异性抗体的体外方法，其中在还原条件下孵育后，在两个单特异性IgG4抗体或IgG4样抗体之间通过“Fab臂”或“半分子”互换(重链与连接的轻链交换)形成双特异性抗体。这种Fab臂互换反应是二硫键异构化反应和CH3域解离-缔合的结果，其中在亲代(原来是单特异性)抗体铰链区的重链二硫键被还原，所得游离半胱氨酸与另一个亲代抗体分子(原来具有不同的特异性)的半胱氨酸残基形成重链间二硫键，同时亲代抗体的CH3域通过解离-缔合释放和再形成。所得产物是具有两个Fab臂的双特异性抗体，所述两个Fab臂可能包含不同序列。但是应当注意的是，该过程是随机的，Fab臂互换也可发生在具有相同序列的两个分子之间，或者两个双特异性分子可参加Fab臂互换以再产生包含原来的单特异性亲代抗体特异性的抗体。现在已惊奇地发现通过在两个单特异性起始蛋白的CH3区引入不对称突变，可迫使Fab臂互换反应变为定向的，从而得到高度稳定的异二聚体蛋白。专利技术概述因此，一方面，本专利技术提供基于稳定的含同二聚体Fc的原料制备高度稳定的含异二聚体Fc的蛋白的有效的体外方法。例如，可基于两种稳定的单特异性抗体作为原料形成具有高收率和纯度的高度稳定的双特异性抗体。因此，一方面，本专利技术涉及用于产生异二聚体蛋白的体外方法，所述方法包括以下步骤：a)提供包含免疫球蛋白Fc区的第一同二聚体蛋白，所述Fc区包含第一CH3区，b)提供包含免疫球蛋白Fc区的第二同二聚体蛋白，所述Fc区包含第二CH3区，其中所述第一CH3区与第二CH3区的序列不同，并使得所述第一CH3区与第二CH3区之间的异二聚体相互作用强于所述第一CH3区与第二CH3区各自的同二聚体相互作用。c)在足以允许铰链区的半胱氨酸进行二硫键异构化的还原条件下将所述第一蛋白与所述第二蛋白一起孵育，和d)获得所述异二聚体蛋白。所述方法可以例如用于体外制备异二聚体蛋白，比如双特异性抗体，用于各种用途，比如治疗或诊断用途。这种体外方法的优点是重链/轻链配对在反应期间保持完整，所以在产物中不会得到不期望的重链与轻链的组合。这与现有技术描述的一些共表达方法(见上文)相反，所述共表达方法中因为在细胞中随机的重链/轻链配对所致，必须发现可与两种重链形成功能性抗体的共用轻链以避免形成非功能性重链/轻链产物。此外，体外方法可在实验室中进行，这与共表达相比允许对异二聚体蛋白更大的控制、更高的灵活性和收率。本专利技术的体外方法还可用于例如在筛选方法中建立更大大小的化合物文库，以鉴定有利的特异性组合。例如，对于抗体靶标的一些组合，并非任何双特异性抗体都将具有功能，即能够同时与两种靶标结合并介导期望的功能效应。在这样的情况下，具有期望的性质(例如最佳靶结合或细胞杀伤)的双特异性抗体，可通过以下步骤鉴定：a)提供第一组具有不同可变区的同二聚体抗体，其中所述第一组的所述抗体包含第一CH3区，b)提供第二组具有不同可变区的同二聚体抗体，其中所述第二组的所述抗体包含第二CH3区，其中所述第一CH3区与第二CH3区的序列不同，并使得所述第一CH3区与第二CH3区之间的异二聚体相互作用强于所述第一CH3区与第二CH3区各自的同二聚体相互作用，c)在足以允许铰链区的半胱氨酸进行二硫键异构化的还原条件下孵育所述第一组抗体与所述第二组抗体的组合，由此产生一组双特异性抗体，d)任选恢复条件至非还原性，e)针对给定的期望性质测定所得双特异性抗体组，和f)选择具有期望性质的双特异性抗体。在另外的方面，本专利技术涉及通过本专利技术方法获得或可获得的异二聚体蛋白和通过在合适的宿主细胞中共表达而制备本专利技术异二聚体蛋白的方法。附图简述图1：通过种间Fab臂互换产生双特异性抗体。通过ELISA确定了在所示EGFR(2F8)与CD20(7D8)IgG4抗体之间GSH诱导的体外Fab臂互换后双特异性抗体的产生。在ELISA中分析0-1μg/mL的浓度系列(总抗体)。恒河猴(Rh)与人(Hu)IgG4抗体之间的Fab臂互换后的双特异性结合高于相同物种的两种抗体之间的Fab臂互换后的双特异性结合。图2：人和恒河猴抗体同种型的核心铰链(即包括两个可能形成重链间二硫键的半胱氨酸残基的人IgG1的CPPC序列，和其它人同种型或其它物种的对应残基)和CH3-CH3界面的氨基酸序列的比对。图3：用参加Fab臂互换的突变人IgG1产生双特异性抗体。通过E本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于产生异二聚体蛋白的体外方法，所述方法包含以下步骤：a)提供包含免疫球蛋白Fc区的第一同二聚体蛋白，所述Fc区包含第一CH3区，b)提供包含免疫球蛋白Fc区的第二同二聚体蛋白，所述Fc区包含第二CH3区，其中所述第一CH3区与第二CH3区的序列不同，并使得所述第一CH3区与第二CH3区之间的异二聚体相互作用强于所述第一CH3区与第二CH3区各自的同二聚体相互作用，c)在足以允许铰链区的半胱氨酸经历二硫键异构化的还原条件下将所述第一蛋白与所述第二蛋白一起孵育，和d)获得所述异二聚体蛋白。

【技术特征摘要】
2010.04.20 DK PA201000330;2010.11.24 DK PA201001061.一种用于产生异二聚体蛋白的体外方法，所述方法包含以下步骤：a)提供包含免疫球蛋白Fc区的第一同二聚体蛋白，所述Fc区包含第一CH3区，b)提供包含免疫球蛋白Fc区的第二同二聚体蛋白，所述Fc区包含第二CH3区，其中所述第一CH3区与第二CH3区的序列不同，并使得所述第一CH3区与第二CH3区之间的异二聚体相互作用强于所述第一CH3区与第二CH3区各自的同二聚体相互作用，c)在足以允许铰链区的半胱氨酸经历二硫键异构化的还原条件下将所述第一蛋白与所述第二蛋白一起孵育，和d)获得所述异二聚体蛋白。2.权利要求1的体外方法，其中所述第一同二聚体蛋白和所述第二同二聚体蛋白选自(i)Fc区，(ii)抗体，(iii)包含Fc区的融合蛋白，和(iv)与前药、肽、药物或毒素缀合的Fc区。3.权利要求1的体外方法，其中所述第一同二聚体蛋...

【专利技术属性】
技术研发人员：AF拉布里恩，J米斯特斯，Evd布雷默，JJ内杰森，Pv伯克尔，Bd戈伊杰，T文克，J范德温克尔，J舒尔曼，P帕伦，
申请(专利权)人：根马布股份公司，
类型：发明
国别省市：丹麦,DK