ε-酮酯还原酶突变体及其催化合成(R)-α-硫辛酸前体的应用制造技术

本发明专利技术涉及ε‑酮酯还原酶经过分子工程改造后催化性能提高的突变体，含有该酶突变体基因的重组表达质粒和重组表达转化体，重组酶的制备方法，以及该重组酶或重组细胞用于催化制备硫辛酸合成前体(R)‑8‑氯‑6‑羟基辛酸乙酯的方法。与现有技术相比，本发明专利技术公开的ε‑酮酯还原酶CpAR2突变体具有热稳定性好、催化活力高的优点，在催化制备(R)‑8‑氯‑6‑羟基辛酸乙酯的反应中展现出底物浓度高、催化剂用量少等显著优势，具有很高的工业应用潜力。

Mutant of e-keto ester reductase and its application in catalytic synthesis of (R) -alpha-lipoic acid precursors

【技术实现步骤摘要】
ε-酮酯还原酶突变体及其催化合成(R)-α-硫辛酸前体的应用
本专利技术属于生化工程
，具体涉及一种ε-酮酯还原酶突变体及其基因序列，含有该突变体基因序列的重组表达质粒和重组表达转化体，共表达ε-酮酯还原酶突变体与葡萄糖脱氢酶的冻干细胞，以及所述ε-酮酯还原酶突变体与共表达ε-酮酯还原酶突变体和葡萄糖脱氢酶的冻干细胞在催化制备(R)-α-硫辛酸前体(R)-8-氯-6-羟基辛酸乙酯中的应用。
技术介绍
α-硫辛酸是一种B族维生素，也是一种安全有效的抗氧化剂，可以高效清除容易致病和加速老化的自由基，其抗氧化作用远远强于维生素C和维生素E，并且在体内可以实现维生素C、维生素E、谷胱甘肽、辅酶Q10等抗氧化剂的还原再生，因此是抗氧化作用网络的中心，被医学界称为“万能抗氧化剂”。除此之外，在临床上α-硫辛酸还常被用于治疗糖尿病周围神经病变和糖尿病肾病。α-硫辛酸作为一种手性化合物，具有两种构型，但是只有天然形式的(R)-构型才具有生理活性。由于其(S)-构型无明显毒副作用，且单一(R)-异构体的价格是(R,S)-混旋体的5倍，所以市售大部分产品仍为混旋体。尽管如此，为了减轻人体代谢(S)-异构体垃圾的负担，高效地制备光学纯的(R)-构型单一对映体α-硫辛酸具有重要的应用价值和广阔的市场前景。人们已经研究开发了很多化学和生物法合成(R)-α-硫辛酸的途径，并不断地追求路线较短、原料易得且操作简便的新工艺。目前(R)-α-硫辛酸的合成方法主要有两类，一是对化学合成的外消旋α-硫辛酸或其前体进行拆分，该途径的理论收率仅50％；二是通过羰基还原酶催化ε-酮酯底物8-氯-6-羰基辛酸乙酯(简称ECOO)的不对称还原反应，生成(R)-α-硫辛酸合成的关键前体(R)-8-氯-6-羟基辛酸乙酯(以下简称(R)-ECHO)，提前将手性中心引入，获得的(R)-ECHO通过与氯化亚砜、二硫化钠进行两步常规的化学反应，即可合成得到(R)-α-硫辛酸，该途径具有100％的理论产率。第二个方法反应条件温和、副产物少，由于省去了常规拆分途径中反复重结晶步骤，大幅度提高了(R)-α-硫辛酸的合成总得率，具有很好的应用前景。本申请专利技术人课题组针对ECOO这一特定工业底物，进行了ε-酮酯还原酶的基因资源智能挖掘和大规模筛选，从实验室自建的先导酶库中成功地发掘获得起源于近平滑假丝酵母(Candidaparapsilosis，其专利保藏号为CGMCC9630)的ε-酮酯还原酶，能有效地催化ECOO的不对称还原反应，成功构建了一条高效制备(R)-α-硫辛酸关键手性前体的酶法合成路线和工艺(Adv.Synth.Catal.,2015,357(8),1697)。公开号为CN106164260A的专利技术专利中公开了重组羰基还原酶CpKR及其突变体CpKRG86E和CpKRG86E/A163S，将重组羰基还原酶CpAR突变体和葡萄糖脱氢酶BmGDH进行基因串联单质粒共表达，直接使用重组共表达的大肠杆菌细胞作为羰基不对称还原生物催化剂，实现了廉价葡萄糖驱动的辅酶循环再生和ε-酮酯底物的完全转化。在优选的实施例中，30gL-1的重组共表达大肠杆菌细胞E.coliBL21/pET28a-CpKRG86E/A163S-BmGDH在12h内催化330gL-1(1.5mol/L)底物的完全转化，催化剂的比生产率为9.8g产品/g催化剂；1L规模反应体系中，10gL-1的重组共表达大肠杆菌细胞在8h内催化220gL-1(1.0mol/L)底物的完全转化，催化剂的比生产率为19.8g产品/g催化剂。尽管如此，重组羰基还原酶CpAR及其突变体在其工业应用过程中所面临的一个重要挑战是酶的热稳定性不足，限制了其反应的温度范围，增加了控温的能源成本；并且由于工业操作过程中酶的失活问题导致实际应用中所需使用的催化剂量较多，不但增加了用酶的成本，而且由于大量蛋白质的存在，对产品进行溶剂萃取时产生较严重的乳化问题，显著增加了反应后续处理的难度和成本，限制了产品的分离收率和品质提升。因此，在重组羰基还原酶CpAR的基础上，进一步开发具有良好热稳定性的高活力ε-酮酯还原酶突变体，减少催化剂用量，是当前(R)-硫辛酸的酶法工业化生产应用亟待解决的技术瓶颈问题，对推进羰基还原酶的产业化应用也具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术针对现有ε-酮酯还原酶在应用过程中存在的催化活性不够高、稳定性不佳的问题，提供了一系列催化活性提高、热稳定性改善的ε-酮酯还原酶突变体，含有该酶突变体基因的重组表达质粒和重组表达转化体，重组共表达ε-酮酯还原酶突变体与BmGDH的重组细胞，以及重组细胞在催化制备手性ε-羟基辛酸酯(R)-ECHO中的应用方法。本专利技术的目的可以通过以下技术方案来实现：本专利技术的技术方案之一：提供ε-酮酯还原酶突变体。一种ε-酮酯还原酶突变体，为如SEQIDNo.2所示氨基酸序列的第131位的丝氨酸、第252位的谷氨酰胺经过一个或两个氨基酸取代后形成的新氨基酸序列构成的，同时具备ε-酮酯还原酶活性的衍生蛋白质。如SEQIDNo.2所示氨基酸序列的蛋白质即是公开号为CN106164260A的专利技术专利中所述羰基还原酶突变体CpKRG86E。所述羰基还原酶突变体CpKRG86E可由SEQIDNo.1所示核酸序列编码。所述羰基还原酶突变体CpKRG86E是由羰基还原酶CpKR突变得到，羰基还原酶CpKR来自于一种近平滑假丝酵母菌(Candidaparapsilosis)，该菌株初始命名为ECU6481，自华东理工大学奉贤校区土样中分离得到，并经分类实验和16SrDNA分析鉴定为近平滑假丝酵母菌。该菌株已于2014年9月1日专利保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC9630，在公开号为CN106164260A的专利技术专利中已经公开。本专利技术中，以公开号为CN106164260A的专利技术专利中所述羰基还原酶突变体CpKRG86E作为母本，进行进一步结构改造，经过一个或几个氨基酸的替换，得到ε-酮酯还原酶热稳定性改善同时活性显著提高的突变体。为方便表述，本专利技术中，将公开号为CN106164260A的专利技术专利中所述羰基还原酶突变体CpKRG86E命名为ε-酮酯还原酶CpAR2。本专利技术通过易错PCR的方法，以SEQIDNo.2所示氨基酸序列作为模板建立突变体库，并对易错突变库中的4000个克隆子进行了筛选。基于第一轮易错随机突变库的活力和热稳定性的并行筛选结果，本专利技术发现在SEQIDNo.2所示氨基酸序列的基础上将第131位的丝氨酸替换成亮氨酸后，具有明显较高的ε-酮酯还原酶活性。以第一轮活力提高的突变体为模板，进行新一轮的随机突变，发现对第252位的谷氨酰胺进行单点替换成异亮氨酸后，其热稳定性得到了改善。根据同源建模以及分子对接的结果分析，131位的丝氨酸是位于活性中心loop上的一个重要氨基酸，与底物的酯基距离较近(在范围内)，所以对其进行点饱和突变，即突变为其它19种氨基酸，然后将效果较优的突变点与252位异亮氨酸突变进行组合，从中筛选ε-酮酯还原酶热稳定性改善、同时活性提高的CpAR2突变体。本专利技术中，所述母本ε-酮酯还原酶CpAR2的活力为120U/mg，为43.5℃，其中的定义为酶在本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种ε‑酮酯还原酶突变体，其特征在于，为如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第131位的丝氨酸、第252位的谷氨酰胺经过一个或两个氨基酸取代后形成的新氨基酸序列构成的衍生蛋白质，同时具备ε‑酮酯还原酶活性。

【技术特征摘要】
1.一种ε-酮酯还原酶突变体，其特征在于，为如SEQIDNo.2所示氨基酸序列的第131位的丝氨酸、第252位的谷氨酰胺经过一个或两个氨基酸取代后形成的新氨基酸序列构成的衍生蛋白质，同时具备ε-酮酯还原酶活性。2.根据权利要求1所述ε-酮酯还原酶突变体，其特征在于，所述ε-酮酯还原酶突变体蛋白质具有如下序列：(1)将如SEQIDNo.2所示氨基酸序列的第131位丝氨酸替换为亮氨酸；(2)将如SEQIDNo.2所示氨基酸序列的第131位丝氨酸替换为苯丙氨酸；(3)将如SEQIDNo.2所示氨基酸序列的第131位丝氨酸替换为酪氨酸；(4)将如SEQIDNo.2所示氨基酸序列的第131位丝氨酸替换为酪氨酸，同时第252位谷氨酰胺替换为异亮氨酸；(5)将如SEQIDNo.2所示氨基酸序列的第131位丝氨酸替换为亮氨酸，同时第252位谷氨酰胺替换为异亮氨酸；(6)将如SEQIDNo.2所示氨基酸序列的第131位丝氨酸替换为苯丙氨酸，同时第252位谷氨酰胺替换为异亮氨酸。3.一种分离的核酸，其特征在于，所述核酸是编码如权利要求1或2所述ε-酮酯还原酶突变体的核酸。4.一种重组表达载体，其特征在于，包含如权利要求3所述的核酸。5.一种重组表达转化体，其特征在于，包含如权利要求4所述的重组表达载体。6.一种如权利要求1或2所述ε-酮酯还原酶突变体的制备方法，其特征在于，包含如下步骤：培养如权利要求5所述的重组表达转化体，获得重组表达的ε-酮酯还原酶突变体。7.一种...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑高伟，许尧，许建和，潘江，钱小龙，
申请(专利权)人：华东理工大学，苏州百福安酶技术有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31