一种新型酶组合物制造技术

本发明专利技术涉及一种N端缺失60至120个氨基酸的酪氨酸羟化酶变体，以及一种药物组合物，其包括N端缺失60至120个氨基酸的酪氨酸羟化酶变体和芳香族L‑氨基酸脱羧酶；本发明专利技术还涉及包括所述酪氨酸羟化酶变体或所述药物组合物的核苷酸构建体、载体质粒、细胞、病毒，以及所述病毒在制备治疗退行性疾病例如帕金森病药物中的用途。

A New Enzyme Composition

【技术实现步骤摘要】
一种新型酶组合物
本专利技术涉及一种药物组合物，其包括酪氨酸羟化酶变体和芳香族L-氨基酸脱羧酶，和其核苷酸构建体、载体质粒、细胞、病毒，以及所述病毒在制备治疗退行性疾病例如帕金森病药物中的用途。属于基因工程

技术介绍
帕金森病(Parkinson′sDisease，PD)是一类严重的神经退行性疾病，以震颤、僵硬和运动障碍为主要症状。病理上主要表现为位于大脑黑质区(substantianigra，SN)的多巴胺(dopamine)能神经元的进行性退化。上述病变将造成纹状体(Striatum)区域的多巴胺能神经元的投射减少及此区域多巴胺浓度的降低。因此，增加纹状体区域多巴胺能传递的药理学方法是治疗PD的有效手段。多巴胺替代疗法，即口服左旋多巴(L-Dopa)，是目前最主要的药物疗法。虽然此疗法在短期内显著改善了PD患者的生活质量，但多巴胺替代疗法的有效性会随着时间逐渐降低，在超过5到10年后，所有患者的病情会最终进展到口服左旋多巴难以治疗的地步。酶替代疗法(enzymereplacementtherapies)的目的是补偿由于黑质区域多巴胺能神经元退化所引起的多巴胺释放的减少。上述方法原理是将编码多巴胺合成所需的酶的基因递送到纹状体的GABA能神经元中。在此条件下，GABA能神经元能够持续异位合成多巴胺，并在相应的纹状体区域释放。这种方法可以减少运动障碍的发生，并限制由基底神经节(basalganglia)外多巴胺水平升高所引起的副作用。然而，多巴胺浓度升高会负反馈调节酪氨酸羟化酶(tyrosinehydroxylase，TH)的活性，从而限制其异位合成多巴胺的能力。因此，寻找疗效更佳的酶替代疗法对于治疗帕金森病至关重要。
技术实现思路
本专利技术提供了一种酪氨酸羟化酶(又简称TH)变体，其中，所述酪氨酸羟化酶变体包括如SEQIDNO：1所示的氨基酸序列的N端缺失60至120个氨基酸的人酪氨酸羟化酶，优选所述酪氨酸羟化酶变体包括如SEQIDNO：1所示的氨基酸序列的N端缺失80至100个氨基酸的人酪氨酸羟化酶，更优选为，如SEQIDNO：1所示的氨基酸序列的N端缺失80至90个氨基酸的人酪氨酸羟化酶，例如如SEQIDNO：1所示的氨基酸序列的N端缺失80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、92、94、95、96、97、98、99、或100个氨基酸的人酪氨酸羟化酶。在一个实施例中，所述酪氨酸羟化酶变体包括如SEQIDNO：2所示的蛋白或与SEQIDNO：1所示的氨基酸序列具有80％序列同一性的酪氨酸羟化酶衍生物，例如80％、90％、95％、99％以上同一性，其中，所述衍生物为由SEQIDNO：1所示氨基酸序列经过一个或少数几个例如2、3、4、5、6、7、8、9、10个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的且具有氨基酸序列如SEQIDNO：1所示的蛋白功能的酪氨酸羟化酶变体，其活性为如SEQIDNO：1所示蛋白的50％以上，例如60％、70％、80％、85％、90％、95％、99％以上。所述酪氨酸羟化酶变体可选择性包含标签蛋白，所述标签蛋白包括但不限于HA、Myc、Flag。在另一方面，本专利技术还提供了一种组合物，包括如前所述酪氨酸羟化酶变体。在一个实施例中，所述的组合物还包括芳香族L-氨基酸脱羧酶，优选全长的芳香族L-氨基酸脱羧酶，其包含如SEQIDNO：4-9中任一序列所示的蛋白或与SEQIDNO：4-9任一序列所示的氨基酸序列具有80％序列同一性的芳香族L-氨基酸脱羧酶衍生物，例如80％、90％、95％、99％以上同一性，其中，所述衍生物为由SEQIDNO：4-9所示氨基酸序列经过一个或少数几个例如2、3、4、5、6、7、8、9、10个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的且具有氨基酸序列如SEQIDNO：4-9所示的蛋白功能的芳香族L-氨基酸脱羧酶衍生物，其活性为如SEQIDNO：4-9所示蛋白的50％以上，例如60％、70％、80％、85％、90％、95％、99％以上。所述芳香族L-氨基酸脱羧酶可选择性包含标签蛋白。所述芳香族L-氨基酸脱羧酶还可选择性在序列N端或C端包含标签蛋白，更优选地，所述标签蛋白包括但不限于HA、Myc、Flag。在一个具体实施例中，所述芳香族L-氨基酸脱羧酶的氨基酸序列如SEQIDNO：10所示。在一个具体实施例中，所述芳香族L-氨基酸脱羧酶蛋白(又简称AADC)可以是来自DDC基因的天然存在的异形体或变体中的任何一种。现有技术中已经鉴别出编码不同AADC异形体的多种交替剪接的转录物变体。具体地，DDC基因产生7种转录物变体，它们编码6种不同的蛋白异形体。DDC基因转录物变体1和2都编码AADC异形体1。在优选的实施方式中，所述全长芳香族L-氨基酸脱羧酶AADC是AADC异形体1(NCBI参照序列：NP_000781.1)，其编码多核苷酸序列是DDC基因转录物变体1或2的编码区序列。本领域技术人员根据现有技术可合理预期这些天然存在的异形体均可以适用于本专利技术中，达到相同的效果，例如SEQIDNO：4-9中任一序列所示的氨基酸序列的AADC。另一方面，本专利技术还提供了一种核苷酸构建体，其包含编码如前所述的酪氨酸羟化酶变体的多核苷酸或如前所述的药物组合物的核苷酸序列。在一个实施例中，所述酪氨酸羟化酶变体的多核苷酸序列如SEQIDNO：12或13或与其具有80％以上，优选80％、90％、95％、99％以上同一性的序列所示，和/或所述芳香族L-氨基酸脱羧酶的多核苷酸序列如SEQIDNO：14-21中任一个或与其具有80％以上，优选80％、90％、95％、99％以上同一性的序列所示。在一个具体实施例中，所述酪氨酸羟化酶的多核苷酸序列为由SEQIDNO：12或13所示核苷酸序列经过一个或少数几个例如2、3、4、5、6、7、8、9、10个核苷酸残基的取代、缺失或添加而形成的核苷酸序列且具有如SEQIDNO：12或13所示功能的变体，其序列与SEQIDNO：12或13具有90％以上，例如95％、99％以上的序列同一性或生物活性。在一个具体实施例中，所述芳香族L-氨基酸脱羧酶的多核苷酸序列为由SEQIDNO：14-21所示核苷酸序列经过一个或少数几个例如2、3、4、5、6、7、8、9、10个核苷酸残基的取代、缺失或添加而形成的核苷酸序列且具有如SEQIDNO：14-21所示功能的变体，其序列与SEQIDNO：14-21具有90％以上，例如95％、99％以上的序列同一性或生物活性。本专利技术提供了一种载体质粒，其包含如前所述的核苷酸构建体。在一个实施例中，酪氨酸羟化酶变体为人源酪氨酸羟化酶变体；芳香族L-氨基酸脱羧酶为人源芳香族L-氨基酸脱羧酶。在一个实施例中，组合物中酪氨酸羟化酶变体的核苷酸序列和芳香族L-氨基酸脱羧酶的核苷酸序列可被构建于同一载体质粒中，也可构建于不同载体质粒中，其中所述载体质粒选自单纯孢疹病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体，对于中枢神经系统(CNS)而言，有效的表达载体包括但不限于病毒载体HSV、Ad或者AAV，优选腺相关病毒AAV。在具体的实施方式中，所述AAV的血清型为AAV9。在具体的实施方式中，所述AAV转基因的长度小于500本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种酪氨酸羟化酶变体，其中，所述酪氨酸羟化酶变体包括如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的N端缺失60至120个氨基酸的酪氨酸羟化酶。

【技术特征摘要】
1.一种酪氨酸羟化酶变体，其中，所述酪氨酸羟化酶变体包括如SEQIDNO：1所示的氨基酸序列的N端缺失60至120个氨基酸的酪氨酸羟化酶。2.如权利要求1所述的酪氨酸羟化酶变体，所述酪氨酸羟化酶变体包括如SEQIDNO：1所示的氨基酸序列的N端缺失80至100个氨基酸的酪氨酸羟化酶。3.如权利要求2所述的酪氨酸羟化酶变体，所述酪氨酸羟化酶变体包括如SEQIDNO：1所示的氨基酸序列的N端缺失80至90个氨基酸的酪氨酸羟化酶。4.如权利要求2或3所述的酪氨酸羟化酶变体，其中所述酪氨酸羟化酶变体包括如SEQIDNO：2所示的蛋白或与SEQIDNO：1所示的氨基酸序列具有80％序列同一性的酪氨酸羟化酶衍生物，优选地，所述酪氨酸羟化酶变体还可选择性在序列N端或C端添加标签蛋白，更优选地，所述标签蛋白可以为HA、Myc、Flag。5.如权利要求4所述的酪氨酸羟化酶变体，其中所述酪氨酸羟化酶变体包括如SEQIDNO：3所示的蛋白。6.一种组合物，包括至少一种如权利要求1至5任一项所述酪氨酸羟化酶变体。7.如权利要求6所述的组合物，还包括芳香族L-氨基酸脱羧酶。8.如权利要求7所述的组合物，所述芳香族L-氨基酸脱羧酶为全长的芳香族L-氨基酸脱羧酶，其包含如SEQIDNO：4-9中任一序列所示的蛋白或与SEQIDNO：4-9任一序列所示的氨基酸序列具有80％序列同一性的芳香族L-氨基酸脱羧酶衍生物，优选地，所述芳香族L-氨基酸脱羧酶还可选择性在序列N端或C端添加标签蛋白，更优选地，所述标签蛋白可以为HA、Myc、Flag。9.如权利要求8所述的组合物，所述芳香族L-氨基酸脱羧酶的序列如SEQIDNO：10所示...

【专利技术属性】
技术研发人员：程诚，郑静，
申请(专利权)人：上海信致医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31