本发明专利技术涉及编码人凝血因子VIII(FVIII)多肽的优化多核苷酸序列。本公开还涉及包含该优化多核苷酸序列的FVIII基因表达盒、重组AAV载体和药物组合物，以及它们在治疗血友病A或获得性因子VIII缺乏症中的应用。本发明专利技术的优化的多核苷酸序列和FVIII基因表达盒具有改善的FVIII表达水平。FVIII表达水平。FVIII表达水平。
【技术实现步骤摘要】
改进的人凝血因子VIII基因表达盒及其应用
[0001]本公开涉及编码因子VIII(FVIII)多肽的优化多核苷酸序列。本公开还涉及包含该优化多核苷酸序列的FVIII基因表达盒、重组AAV载体和药物组合物，以及它们在治疗血友病A或获得性因子VIII缺乏症中的应用。
技术介绍
[0002]因子VIII(FVIII)通过加速因子X转化为因子Xa而在凝血级联(coagulation cascade)中起关键作用。血友病A是一种以缺乏FVIII活性为特征的先天性X连锁性出血性病症。降低的FVIII活性抑制了凝血级联中的正反馈回路。常规地，通过FVIII替代疗法来治疗血友病A，即，向血友病A患者施用FVIII蛋白(例如静脉输注血浆源的或重组的FVIII蛋白)。尽管这种治疗能有效控制出血发作，但由于FVIII的半衰期短(8
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12小时)，频繁输注的要求使其固有成本高昂。
[0003]基于腺相关病毒(AAV，adeno
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associated virus)的基因疗法是最终治愈这种疾病的有吸引力的策略。然而，使用AAV递送FVIII基因的进展不太理想，FVIII在体内的表达效率较低。已有一些试图改变FVIII密码子以提高蛋白表达水平的尝试，但取得的成功有限。
技术实现思路
[0004]鉴于现有技术的上述缺陷与不足，本公开提供了表达水平提高的优化的FVIII多核苷酸序列以及体内表达水平提高的FVIII基因表达盒构建体。本专利技术人意外地发现，与具有较完整元件的FVIII基因表达盒相比，剔除部分调控元件(例如，增强子、内含子、特别是5
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UTR)的FVIII基因表达盒经AAV载体递送至细胞内后仍可以保持相当的甚至是显著改善的FVIII表达水平，由此完成了本专利技术。
[0005]在第一方面，本公开提供一种编码因子VIII(FVIII)多肽的多核苷酸，其中，所述多核苷酸的核苷酸序列与SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列具有至少80％的同一性，优选具有至少85％、90％、95％、99％的同一性。
[0006]在一个实施方案中，上述多核苷酸包含SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列。在一个优选实施方案中，上述多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7所示。
[0007]在一个实施方案中，上述多核苷酸表达B结构域缺失的因子VIII多肽(FVIII
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BDD)。
[0008]本公开的优化的FVIII多核苷酸序列相比于未经优化的FVIII多核苷酸序列可显著提高FVIII蛋白的表达水平。
[0009]在第二方面，本公开提供一种因子VIII基因表达盒，其包括以下元件，优选由以下元件组成：启动子、可选的kozak序列、编码B结构域缺失的因子VIII多肽的多核苷酸(例如根据第一方面所述的多核苷酸)、多聚腺苷酸(poly A)，以及位于两端的两个ITR。
[0010]在一个实施方案中，因子VIII基因表达盒中各元件之间直接连接或通过接头间接连接。
[0011]在一个实施方案中，启动子为泛表达启动子、组成型肝特异性启动子或人工合成型肝特异性启动子。在一个优选实施方案中，启动子为人工合成型肝特异性启动子。在一个更优选实施方案中，启动子为SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10所示的肝特异性启动子。
[0012]在一个实施方案中，两个ITR各自独立地为正常ITR或截短ITR。在一个优选实施方案中，两个ITR各自独立地为SEQ ID NO：14所示的正常ITR或SEQ ID NO：15所示的截短ITR。在一个更优选实施方案中，两个ITR均为SEQ ID NO：15所示的截短ITR。
[0013]在一个实施方案中，因子VIII基因表达盒还包括以下元件中的一种以上：增强子、5
’
非翻译区(5
’
UTR)和内含子。
[0014]在一个实施方案中，增强子为组成型增强子或人工合成型增强子；优选SEQ ID NO：8所示的增强子。
[0015]在一个实施方案中，内含子为组成型内含子或人工合成型内含子；优选SEQ ID NO：12所示的内含子。
[0016]在一个实施方案中，因子VIII基因表达盒的核苷酸序列如SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：18所示。
[0017]在第三方面，本公开提供一种重组AAV载体，其包括：根据第二方面所述的因子VIII基因表达盒和AAV衣壳蛋白。
[0018]在一个实施方案中，AAV衣壳蛋白为天然AAV衣壳蛋白或人工改造的AAV衣壳蛋白；优选地，AAV选自：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10和AAV11。
[0019]在第四方面，本公开提供根据第三方面所述的重组AAV载体在制备用于预防或治疗血友病A或获得性因子VIII缺乏症的药物中的应用。
[0020]在第五方面，本公开提供一种药物，其包含根据第三方面所述的重组AAV载体和可选的赋形剂。
[0021]在一个实施方案中，赋形剂包括：盐、有机物和表面活性剂。
[0022]在一个实施方案中，药物通过全身途径或局部途径施用，例如口服、经直肠、经粘膜、鼻内、吸入、颊内(例如舌下)、阴道、鞘内、眼内、透皮、子宫内(或卵内)、肠胃外(例如静脉内、皮下、皮内、肌内、皮内、胸膜内、脑内和关节内)、淋巴内、局部接触、病灶内施用。
[0023]在第六方面，本公开提供一种预防或治疗血友病A或获得性因子VIII缺乏症的方法，包括向有需要的受试者施用治疗有效量的根据第一方面所述的多核苷酸、根据第二方面所述的因子VIII基因表达盒、根据第三方面所述的重组AAV载体、根据第五方面所述的药物和/或根据第八方面所述的宿主细胞。
[0024]在第七方面，本公开提供一种将因子VIII基因递送至靶细胞中的方法，包括：1)将根据第二方面所述的因子VIII基因表达盒包装于AAV衣壳蛋白中，形成根据第三方面所述的重组AAV载体；以及2)使所述靶细胞与所述重组AAV载体接触。
[0025]在一个实施方案中，靶细胞是离体细胞。在一个实施方案中，靶细胞是体内细胞。
[0026]在第八方面，本公开提供一种宿主细胞，其用根据第三方面所述的重组AAV载体感染。
[0027]在第九方面，本公开提供一种生产重组AAV载体的方法，包括将根据第一方面所述
的多核苷酸引入哺乳动物宿主细胞中，所述哺乳动物宿主细胞包含AAV rep基因、AAV cap基因和病毒复制辅助基因。
[0028]在下面的描述中更详细地阐述了本公开的上述和其它方面。
附图说明...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种编码因子VIII(FVIII)多肽的多核苷酸，其中，所述多核苷酸的核苷酸序列与SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列具有至少80％的同一性；优选地，所述多核苷酸的核苷酸序列与SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列具有至少85％、90％、95％、99％的同一性。2.根据权利要求1所述的多核苷酸，其中，所述多核苷酸包含SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列；优选地，所述多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7所示。3.根据权利要求1或2所述的多核苷酸，其中，所述多核苷酸表达B结构域缺失的因子VIII多肽(FVIII
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BDD)。4.一种因子VIII基因表达盒，其包括以下元件，优选由以下元件组成：启动子、可选的kozak序列、编码B结构域缺失的因子VIII多肽的多核苷酸(优选权利要求1至3中任一项所述的多核苷酸)、多聚腺苷酸(poly A)，以及位于两端的两个ITR。5.根据权利要求4所述的因子VIII基因表达盒，其中，各元件之间直接连接或通过接头间接连接。6.根据权利要求4所述的因子VIII基因表达盒，其中，所述启动子为泛表达启动子、组成型肝特异性启动子或人工合成型肝特异性启动子；优选地，启动子为人工合成型肝特异性启动子；更优选地，所述启动子为SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10所示的肝特异性启动子。7.根据权利要求4至6中任一项所述的因子VIII基因表达盒，其中，所述两个ITR各自独立地为正常ITR或截短ITR；优选地，所述两个ITR各自独立地为SEQ ID NO：14所示的正常ITR或SEQ ID NO：15所示的截短ITR。8.根据权利要求4至7中任一项所述的因子VIII基因表达盒，其中，所述因子VIII基因表达盒还包括以下元件中的一种以上：增强子、5
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UTR和内含子。9.根据权利要求8所述的因子VIII基因表达盒，其中...
【专利技术属性】
技术研发人员：胡晗阳，李丹丹，徐悦，陈晨，袁龙辉，王新涛，王天翼，杜增民，蒋威，吴侠，郑静，肖啸，
申请(专利权)人：上海信致医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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