黑翅土白蚁革兰氏阴性菌识别蛋白GNBP1基因及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种靶向沉默黑翅土白蚁革兰氏阴性菌识别蛋白GNBP1基因的dsRNA及其在白蚁防治中的应用。其中，黑翅土白蚁GNBP1基因其核苷酸序列为SEQ ID NO：1。本专利建立了利用饲喂法进行黑翅土白蚁GNBP1 RNA干扰体系，发现单独使用黑翅土白蚁GNBP1 dsRNA，对白蚁有就具有很高的致死率。此外，利用黑翅土白蚁GNBP1 dsRNA与生防菌联用，能显著提高生防菌的防治效果。因此，本发明专利技术基于免疫识别蛋白GNBP1基因设计了dsRNA，建立了利用饲喂法进行的黑翅土白蚁GNBP1 RNA干扰体系，并得出饲喂在黑翅土白蚁中取得了明显的基因沉默效果，为GNBP1 RNAi技术应用提供了技术支持。RNAi技术应用提供了技术支持。RNAi技术应用提供了技术支持。

【技术实现步骤摘要】
黑翅土白蚁革兰氏阴性菌识别蛋白GNBP1基因及其应用


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及一种黑翅土白蚁革兰氏阴性菌识别蛋白 GNBP1基因及其应用。

技术介绍

[0002]白蚁是世界最著名的害虫之一，是一种社会性昆虫，具有强大的生殖力和存活力。主要危害房屋建筑、农林作物、水库土坝、电缆桥梁、交通设施等，对非纤维素物质也经常进行蛀蚀。黑翅土白蚁属于高等白蚁，是土白蚁的一种。大多数时间活动在地下。主要以工蚁危害树皮及浅木质层，以及根部。造成被害树干外形成大块蚁路，长势衰退。当侵入木质部后，则树干枯萎；尤其对幼苗，极易造成死亡。采食危害时做泥被和泥线，严重时泥被环绕整个干体周围而形成泥套，其特征很明显。黑翅土白蚁是水库、江河堤坝的主要害虫，可经常造成堤坝漏水、塌方和溃口(李栋等，2001；蔡邦华等，1965；徐振海，2004；徐志德等，2007)。由于黑翅土白蚁的巢穴隐蔽性非常强，因此其造成的危害不容易被发觉，当被察觉时，此时的损害已经非常之巨大。此外，黑翅土白蚁食性较杂，危害范围较广，可为害包括樟树、杉树、广玉兰、枫杨等在内的100多种植物(黄求应等；2005)。
[0003]目前对黑翅土白蚁防治仍主要依赖于传统的化学农药，但药剂残留等问题日益严重，对人畜健康和生态环境具有潜在的威胁。因此，发掘新的生物防治方法、探索新的黑翅土白蚁防治策略势在必行。RNA干扰(RNA interference，RNAi)是指在真核生物中由双链RNA(double
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stranded RNA，ds RNA)诱发同源mRNA降解，使靶基因表达沉默的现象，在昆虫基因功能的研究中，一般通过引入外源的dsRNA或小干扰 RNA(small interfering RNA,si RNA)进行基因干扰。RNAi能够通过选择性地干扰昆虫关键基因的表达，达到对害虫种群的可持续控制，在害虫防治领域被寄予厚望。革兰氏阴性菌识别蛋白(gram
‑
negative binding proteins)GNBPs，也称β
‑
1，3
‑
葡聚糖识别蛋白(β
‑
1，3
‑
glucan recognition proteins，βGRPs)是同一个家族成员，最早在家蚕中发现并命名，其主要负责真菌的识别(Beaulaton et al，1979)，及后续的免疫信号转导引发抗菌肽基因表达中起重要作用。沉默该基因可使白蚁抵御病原微生物侵染的能力降低，最终导致其死亡，因此，有望通过RNA干扰技术，针对GNBP基因设计了 dsRNA用于黑翅土白蚁防治。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供黑翅土白蚁GNBP1基因的dsRNA在白蚁防治中的应用。其中，黑翅土白蚁GNBP1基因由申请人首次发现，基于该基因设计dsRNA并导入到白蚁体内，可以有效防治黑翅土白蚁。
[0005]具体地，本专利技术提出了一种黑翅土白蚁革兰氏阴性菌识别蛋白GNBP1基因，所述 GNBP1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。其对应的氨基酸序列如SEQ ID NO： 2所述。
[0006]本专利技术进一步提出了GNBP1基因在白蚁防治中的应用。
[0007]同时，本专利技术提出了一种防治白蚁的GNBP1 dsRNA，其由SEQ ID NO：1所示的核苷
酸序列转录而成。
[0008]本专利技术还提供了编码权利上述GNBP1 dsRNA的DNA。
[0009]进一步地，本专利技术提供了重组表达载体，其包含上述编码dsRNA的DNA。
[0010]本专利技术还提供一种宿主菌，转化所述重组表达载体。
[0011]另一个方面，本专利技术提出了一种防治白蚁的方法，包括以下步骤：用GNBP1 dsRNA 饲喂白蚁，所述dsRNA由如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列转录而成。
[0012]作为另外一种防治白蚁的方法，可以用GNBP1 dsRNA和粘质沙雷氏菌SM1共同饲喂白蚁，其中，所述dsRNA由如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列转录而成。
[0013]有益效果：本专利技术基于免疫识别蛋白GNBP1基因设计了dsRNA，研究建立了利用饲喂法进行黑翅土白蚁GNBP1 RNA干扰体系，并得出饲喂在黑翅土白蚁中取得了明显的基因沉默效果，为GNBP1 RNAi技术应用提供了理论依据。同时，通过使用HT115 菌株构建dsRNA表达体系，压缩了干扰成本。本专利技术利用该体系成功干扰了免疫识别蛋白GNBP1基因的表达，并发现GNBP1基因沉默的黑翅土白蚁对粘质沙雷氏菌SM1 菌株敏感性显著提高。通过实验发现GNBP1 dsRNA与SM1同时使用，白蚁的死亡率明显提高，说明其可以提高生防菌的防治效果；同时还发现，单独使用GNBP1 dsRNA也能对黑翅土白蚁起到防治效果，其效果与单独使用SM1相当。这些为GNBP1dsRNA在白蚁防治中的应用提供了理论依据。
附图说明
[0014]图1为黑翅土白蚁总RNA电泳图；
[0015]图2为GNBP1的克隆序列和推导的氨基酸序列；
[0016]图3为粘质沙雷氏菌处理黑翅土白蚁后GNBP1表达量；
[0017]图4为L4440
‑
dsGNBP1和L4440
‑
dsGFP重组质粒电泳结果图，其中，1是 L4440
‑
dsGFP，2是L4440
‑
dsGNBP1；
[0018]图5为dsRNA消化电泳结果，其中，1是dsGFP，2是dsGNBP1；
[0019]图6为dsRNA饲喂后不同时间采样目的基因的相对表达量，其中，注：不同小写字母表示处理间差异显著；ABCD分别为3、6、12、24h；
[0020]图7为dsRNA处理6h后生存分析，其中，ABCDEF分别为11、16、21、26、 31、36h；G为生存分析图，虚线为使用SM1处理的时间。
具体实施方式
[0021]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所使用的材料、试剂等，如无特别说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
[0022]实施例中涉及的实验材料和方法：
[0023](1)供试昆虫：黑翅土白蚁采集自江苏省句容市，蚁巢采回后放于27℃黑暗条件下昆虫恒温箱中进行饲养。
[0024](2)粘质沙雷氏菌SM1的培养
[0025]培养基：细菌基础培养基(g/L)：蛋白胨10g，牛肉提取物20g，NaCl 2g，K2HPO
4 2g，琼脂18g pH 7.2～7.4。
[0026]细菌种子培养基(g/L)：蛋白胨10g，酵母提取物20g，NaCl 2g，K2HPO
4 2g。
[0027]细菌发酵培养基(g/L)：蛋白胨10g，大豆油30g，NaCl 2g，K2HPO
4 2g。
[0028]将分离出的粘质沙雷氏菌菌株SM1本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种黑翅土白蚁革兰氏阴性菌识别蛋白GNBP1基因，其中，所述GNBP1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。2.权利要求1所述的GNBP1基因在白蚁防治中的应用。3.一种防治白蚁的dsRNA，其特征在于，其由SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列转录而成。4.一种编码权利要求2所述的dsRNA的DNA。5.一种重组表达载体，其特征在于，包含权利要求4所述的编码dsRNA的DNA。...

【专利技术属性】
技术研发人员：汤方，丰凯，
申请(专利权)人：南京林业大学，
类型：发明
国别省市：