用于检测E.ColiDNA残留的引物探针组合、试剂盒和应用制造技术

本发明专利技术涉及一种基于TaqMan探针法的用于检测E.Coli DNA残留的引物探针组合、包含其的试剂盒以及它们用于检测E.Coli DNA残留的应用。本发明专利技术具有操作简单、定量精准、特异性强、检测周期短、检测成本低等优点，特别适合用于E.Coli DNA残留检测，具有广阔的应用前景。具有广阔的应用前景。具有广阔的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
用于检测E.Coli DNA残留的引物探针组合、试剂盒和应用


[0001]本专利技术涉及生物分析检测领域，更具体地涉及基于TaqMan探针法的用于检测E.Coli DNA残留的引物探针组合、包含其的试剂盒以及它们的应用。

技术介绍

[0002]基因治疗是指将有正常功能的基因或其他基因通过基因转移方式(例如通过质粒载体)导入到患者体内，并使之表达功能正常的基因，或表达患者原来不存在或表达很低的外源基因，从而达到治疗目的。与常规治疗手段相比，基因治疗能从DNA源头上解决疾病的发生，从而实现单次治疗带来长期疗效。
[0003]腺相关病毒(AAV)载体治疗更是其中最重要的治疗技术之一。作为目前最有前途的基因治疗载体，AAV载体具有宿主范围广、非致病性、低免疫原性、长期稳定表达外源基因、良好的扩散性能和物理性质稳定等优点，因而在临床试验中得到广泛应用。AAV的生产平台主要有三种：三质粒转染体系、杆状病毒表达载体体系和包装细胞体系。目前，“三质粒转染”技术仍然占据AAV基因治疗的主流地位。
[0004]然而，在细菌扩增培养到质粒DNA纯化的整个过程中，由于酶解和机械剪切力的作用，宿主基因组DNA非常容易断裂，导致最终的质粒纯化产物中往往会存在一定量的宿主基因组DNA，而宿主基因组DNA片段不利于真核细胞的基因转染。因此，基因治疗对重组质粒DNA的质量要求十分严苛，质粒的质量会严重影响转染效率和AAV的产量和质量。根据WHO的相关规定，符合体内使用质量标准的质粒制品中的宿主基因组DNA含量必须控制在可接受的较低水平。
[0005]实时荧光定量PCR(qPCR)是一种实时荧光测定PCR循环后产物总量的方法，常用于对质粒中E.Coli DNA残留量进行检测。qPCR可在宽浓度范围内以高精度对样品的初始模板拷贝数或浓度进行定量。qPCR具有操作简便、灵敏度高、重复性好等优点，广泛应用于生命科学研究的各个领域，例如基因的差异表达分析、SNP检测、等位基因的检测、药物开发、临床诊断、转基因研究等。
[0006]常用的qPCR方法包括染料法和TaqMan探针法。相比于染料法，基于TaqMan探针法的实时荧光定量PCR技术具有操作简便、特异性高且重复性好的优点。TaqMan探针法荧光定量PCR适用于病原体检测、宿主核酸残留检测、疾病耐药基因研究、药物疗效考核、遗传疾病的诊断等。新型TaqMan
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MGB探针还可用于分析基因突变，有望成为基因诊断和个体化用药分析的首选技术平台。
[0007]基于此，本专利技术人基于TaqMan探针法对质粒中E.Coli DNA残留检测进行了研究。

技术实现思路

[0008]本专利技术的目的是提供基于TaqMan探针法的用于检测质粒中E.Coli DNA残留的引物探针组合、包含其的试剂盒和它们的相关应用，以及使用它们的检测方法。
[0009]在一方面，本专利技术提供了用于检测E.Coli DNA残留的如下5组引物探针组合：
[0010]第1组：SEQ ID NO：1所示的正向引物、SEQ ID NO：2所示的反向引物和SEQ ID NO：3所示的探针；
[0011]第2组：SEQ ID NO：4所示的正向引物、SEQ ID NO：5所示的反向引物和SEQ ID NO：6所示的探针；
[0012]第3组：SEQ ID NO：7所示的正向引物、SEQ ID NO：8所示的反向引物和SEQ ID NO：9所示的探针；
[0013]第4组：SEQ ID NO：10所示的正向引物、SEQ ID NO：11所示的反向引物和SEQ ID NO：12所示的探针；以及
[0014]第5组：SEQ ID NO：13所示的正向引物、SEQ ID NO：14所示的反向引物和SEQ ID NO：15所示的探针。
[0015]优选地，上述探针的5'端用荧光报告基团进行标记，3'端用荧光淬灭基团进行标记。
[0016]优选地，所述荧光报告基团选自FAM、JOE、ROX、TET、TAMRA、HEX、VIC、CY3、CY5或Texas Red，所述荧光淬灭基团选自BHQ、TAMRA、Eclipse、DABCYL、Lowa Black
TM RQ或Lowa Black
TM FQ。
[0017]优选地，所述荧光报告基团为FAM，所述荧光淬灭基团为TAMRA。
[0018]优选地，所述引物探针组合为选自第1组(SEQ ID NO：1所示的正向引物、SEQ ID NO：2所示的反向引物和SEQ ID NO：3所示的探针)和第2组(SEQ ID NO：4所示的正向引物、SEQ ID NO：5所示的反向引物和SEQ ID NO：6所示的探针)的引物探针组合。
[0019]更优选地，所述引物探针组合为第2组的引物探针组合：SEQ ID NO：4所示的正向引物、SEQ ID NO：5所示的反向引物和SEQ ID NO：6所示的探针。
[0020]在另一方面，本专利技术提供了一种用于检测E.Coli DNA残留的试剂盒，其包含上述引物探针组合中的一种以上。
[0021]优选地，所述试剂盒还包含PCR预混液(也称为Mix)，所述PCR预混液包含DNA聚合酶、dNTP、镁离子和缓冲体系。
[0022]在另一方面，本专利技术提供了一种用于检测E.Coli DNA残留的方法，包括：使用上述试剂盒，对E.Coli DNA标准品进行实时荧光定量PCR，绘制标准曲线；使用上述试剂盒，对样品进行实时荧光定量PCR；以及根据所得标准曲线计算样品中E.coli DNA的量。
[0023]优选地，所述实时荧光定量PCR的反应程序为：
[0024]在95℃下预变性10min；以及
[0025]在95℃下变性10s，然后在60℃下退火30s，之后在72℃下延伸30s，该过程进行40个循环。
[0026]优选地，所述方法适用于检测浓度为0.01pg/μL至1000pg/μL的E.Coli DNA。
[0027]优选地，所述方法的检测限为0.01pg/μL。
[0028]在另一方面，本专利技术提供了上述引物探针组合或包含其的试剂盒在检测E.Coli DNA残留中的非诊断应用。
[0029]基于本专利技术所述的用于检测E.Coli DNA残留的引物探针组合或包含其的试剂盒的方法的检测浓度范围宽(0.01pg/μL至1000pg/μL)、准确性高、检测限得到极大改进(检测限为0.01pg/μL)，有望提供一种可靠的E.Coli DNA残留检测平台，应用前景广阔。
附图说明
[0030]图1显示了大肠杆菌O157:H7 Sakai菌株23S核糖体RNA基因的全序列；
[0031]图2显示了SYBR Green法qPCR的熔解曲线(横坐标T，纵坐标F)；以及
[0032]图3显示了SYBR Green法qPCR的熔解曲线(横坐标T，纵坐标dF/dT)。
具体实施方式...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于检测E.Coli DNA残留的引物探针组合，其特征在于，所述引物探针组合选自如下：SEQ ID NO：1所示的正向引物、SEQ ID NO：2所示的反向引物和SEQ ID NO：3所示的探针；SEQ ID NO：4所示的正向引物、SEQ ID NO：5所示的反向引物和SEQ ID NO：6所示的探针；SEQ ID NO：7所示的正向引物、SEQ ID NO：8所示的反向引物和SEQ ID NO：9所示的探针；SEQ ID NO：10所示的正向引物、SEQ ID NO：11所示的反向引物和SEQ ID NO：12所示的探针；以及SEQ ID NO：13所示的正向引物、SEQ ID NO：14所示的反向引物和SEQ ID NO：15所示的探针；其中，各探针的5'端用荧光报告基团进行标记，3'端用荧光淬灭基团进行标记。2.根据权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于，所述荧光报告基团选自FAM、JOE、ROX、TET、TAMRA、HEX、VIC、CY3、CY5或Texas Red，所述荧光淬灭基团选自BHQ、TAMRA、Eclips...

【专利技术属性】
技术研发人员：王新涛，孙浩行，刘素丽，杜增民，蒋威，郑静，肖啸，吴侠，郑浩，袁龙辉，岳占龙，王瑞霞，王天翼，
申请(专利权)人：上海信致医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：