抗PD-1/CD47的双特异性抗体及其应用制造技术

本发明专利技术提出了一种重组抗体。该重组抗体包括：抗PD‑1的抗体；以及人SIRPA胞外段，所述人SIRPA胞外段的N端与所述抗PD‑1的抗体的重链的C端相连。该重组抗体同时靶向PD‑1和CD47，可以显著增加两者的刺激免疫系统的能力，比单靶抗体表现出更强的肿瘤抑制能力。

Bispecific Antibody Against PD-1/CD47 and Its Application

The invention provides a recombinant antibody. The recombinant antibody includes an anti-PD_ 1 antibody and an extracellular segment of human SIRPA, the N-terminal of which is connected to the C-terminal of the heavy chain of the anti-PD_ 1 antibody. The recombinant antibody targeting both PD_1 and CD47 can significantly increase the ability of both to stimulate the immune system and show stronger tumor inhibition than single target antibody.

【技术实现步骤摘要】
抗PD-1/CD47的双特异性抗体及其应用
本专利技术涉及免疫学和抗体工程
，具体涉及抗PD-1及CD47的双特异性抗体及其应用，更具体地，本专利技术涉及重组抗体、核酸、构建体、制备重组抗体地方法以及治疗癌症的治疗组合物。
技术介绍
近年来癌症成为全球导致死亡的主要原因之一。根据世界卫生组织报道，2015年全世界因癌症死亡人数达近880万，已占当年总死亡人数的近六分之一。2015年中国约有429.2万癌症新发病例，281.4万癌症死亡病例，而且癌症发病率在我国仍呈上升趋势。目前对于癌症的治疗手段仍以进行手术、放射性治疗和化学治疗为主，传统的治疗手段有着肿瘤特异性差和毒副作用大等缺点。因此，人们对于更加安全高效和特异性强的手段来治疗癌症有着强烈的需求。近些年来，随着人们对于癌症的机理认识不断加深，通过特异性抗体来抑制肿瘤的分子靶向治疗逐渐崭露头角。在此基础上的抗体药物是以细胞工程技术和基因工程技术为主体的抗体工程技术制备的药物，具有特异性高，疗效显著，毒副作用少等优点，对肿瘤治疗有非常广阔的前景。近些年来，一些免疫检查点(immunogicalcheckpoint)的不断发现，针对这些免疫检查点的特异性抗体被开发出来阻断肿瘤细胞免疫逃逸的过程，把免疫疗法推向新一波高潮。在免疫系统中，T细胞的活化过程是复杂的，不仅取决于MHC-TCR复合体提供的第一刺激信号，还需要抗原呈递细胞表面的一些分子提供的第二信号(也即“共刺激信号”)。缺乏这类共刺激信号会导致T细胞的无应答、耐受及凋亡[1]。程序性死亡受体－1(programmeddeath-1,PD-1，又称CD279)及其配体程序性死亡受体配体1和2(PD-L1和PD-L2)即是这样一类抑制性的共刺激分子。人的PD-1属于CD28家族成员的Ⅰ型跨膜糖蛋白，其分子量约为55kDa。人PD-1的胞内区存在两个酪氨酸残基(Y223及Y248)，分别参与构成了N端的一个免疫受体酪氨酸抑制基序(immunoreceptortyrosine-basedinhibitorymotif，ITIM，基序为VDYGEL)和C端的一个免疫受体酪氨酸依赖的转换基序(immunoreceptortyrosin-basedswitchmotif，ITSM，基序为TEYATI)。ITIM基序可招募胞内的SHP-2并磷酸化下游的蛋白，降低BCR或TCR受体信号，最终抑制淋巴细胞的增殖及细胞因子的产生并诱导细胞分裂周期停滞[2]。胞外区有一个IgV样结构域，含有多个糖基化位点并被重度糖基化，主要参与与配体结合，从而发挥抑制T细胞活化的功能。与其他共刺激分子以二聚体形式存在不同，PD-1的胞外区缺乏半胱氨酸残基，因此PD-1可以以单体的形式存在。PD-1在活化的T及B细胞表达，也在单核细胞、树突状细胞(dendriticcells，DCs)和调节性T细胞(Tregulatorycells，Tregs)中表达。PD-1的两种配体，PD-L1(B7-H1，又称CD274)和PD-L2(B7-DC)，是Ⅰ型糖蛋白，属于B7家族蛋白成员[3]。PD-1的主要配体PD-L1含有IgV样区、IgC样区、跨膜区和胞质区，其中胞质区参与细胞内信号转导，IgV样区和IgC样区则参与细胞间的信号转导。其表达受一些炎症因子的正向调控，如白细胞介素4(IL-4)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和干扰素γ(IFN-γ)等[4]。除了表达在活化的T细胞、B细胞、巨噬细胞、树突状细胞和多种肿瘤细胞外，PD-L1还广泛表达在非淋巴器官如心脏、血管、胎盘、骨骼肌、肺、肝、脾及胸腺等器官。PD-L2主要只在活化的巨噬细胞、DCs和少数肿瘤细胞上表达[5]。PD-1/PD-L1信号通路的免疫抑制作用对多种免疫失调性疾病的发生与发展具有重要作用。例如自身免疫性疾病。缺失PD-1的小鼠会出现延迟性、器官特异性自身免疫。PD-1的缺失情况在涉及自身免疫性疾病的红斑狼疮的LPR模型及糖尿病的NOD小鼠模型下均体现出加速的组织特异性自身免疫表征[6]。此外在一些病毒诸如HIV和HBV等的慢性感染者体内都发现了过量表达PD-1的功能缺陷的细胞毒性T(cytotoxiclymphocyte,CTL)细胞，而阻断PD-1信号则可逆转CTL的“功能缺失”状态并清除病毒[7]。肿瘤细胞会利用PD-1/PD-L1信号通路的免疫抑制作用来实施免疫逃逸。多种肿瘤细胞会上调表达PD-L1，如非小细胞肺癌(Non-SmallCellLungCancer,NSCLC)、黑色素瘤、淋巴瘤、乳腺癌、白血病及各种泌尿系肿瘤、消化道肿瘤、生殖系肿瘤等[8]。过量表达PD-L1从而与T细胞表面的PD-1受体相互作用，使PD-1的ITSM结构域中的酪氨酸被磷酸化，进而引起下游磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)和酪氨酸激酶(Syk)的去磷酸化，抑制下游AKT、ERK等通路的活化，最终抑制T细胞活化所需基因及细胞因子的转录和翻译[5]。另一方面，研究表明PD-L1引起PD-1在T细胞的积累，导致细胞周期停滞，使在G0/G1期的细胞大量积累[9]。体外实验和小鼠模型还发现，激活PD-1/PD-L1信号通路导致特异性CTL调亡，使CTL的细胞毒杀伤效应敏感性下降，促使肿瘤细胞发生免疫逃逸[10]。综上所述，肿瘤细胞通过表达PD-L1和T细胞表面的PD-1作用，能够抑制T细胞的活化、增殖及对肿瘤的杀伤。因此，PD-1/PD-L1信号通路成为了肿瘤免疫治疗的新分子靶标，PD-1/PD-L1信号通路在肿瘤免疫中起到关键性作用，阻断PD-1/PD-L1信号通路可以阻断肿瘤细胞抑制细胞免疫的主力军T细胞。抗PD-1和抗PD-L1抗体的开发已经成为肿瘤免疫治疗研究中的热点研究方向。目前美国FDA已经批准使用的针对PD-1靶点的单抗药物有默克公司(Merck)的Keytruda(pembrolizumab)和百时美施贵宝公司(Bristol-MyersSquibb)的Opdivo(Nivolumab)。针对PD-L1靶点的单抗药物有罗氏(Roche)的Tecentriq(Atezolizumab)、辉瑞(Pfizer)和默克(Merck)生产的Bavencio(avelumab)和阿斯利康(AstraZeneca)生产的Imfinzi(Durvalumab)。这些单抗药物在从最开始临床上用于治疗黑色素瘤和化疗后依然进展的转移性鳞状非小细胞肺癌等多种肿瘤，到现在用于霍奇金淋巴瘤、肾癌、胃癌、肛门癌、肝癌、结直肠癌等肿瘤类型都已经取得了较好的临床试验结果。另外还有多个抗PD-1和抗PDL1的抗体进入临床试验用于多种肿瘤的治疗。但目前免疫疗法的最大限制在于有效率太低，PD-1的有效率从15％-50％不等。有研究证据表明，成功的癌症免疫疗法取决于能否触发系统广泛的免疫相应，而不是仅触发肿瘤本身的局部影响，刺激免疫系统产生更系统的响应有望显著增加免疫疗法的有效性。
技术实现思路
本专利技术旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，在本专利技术的第一方面，本专利技术提出了一种重组抗体。根据本专利技术的实施例，所述重组抗体包括：抗PD-1的抗体；以及人SIRPA胞外段，所述人SIRPA胞外段的N端与所述抗PD本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组抗体，其特征在于，包括：抗PD‑1的抗体；以及人SIRPA胞外段，所述人SIRPA胞外段的N端与所述抗PD‑1的抗体的重链的C端相连。

【技术特征摘要】
1.一种重组抗体，其特征在于，包括：抗PD-1的抗体；以及人SIRPA胞外段，所述人SIRPA胞外段的N端与所述抗PD-1的抗体的重链的C端相连。2.根据权利要求1所述的重组抗体，其特征在于，所述抗PD-1的抗体为抗PD-1的IgG类抗体，任选地，所述抗PD-1的抗体为H8，任选地，进一步包括连接肽，所述连接肽的N端与所述抗PD-1的抗体的重链的C端相连，所述连接肽的C端与所述人SIRPA胞外段的N端相连，任选地，所述连接肽具有SEQIDNO:1所示的氨基酸序列。3.一种重组抗体，其特征在于，所述重组抗体的轻链具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列，所述重组抗体的重链具有SEQIDNO:3所示的氨基酸序列。4.一种核酸，其特征在于，所述核酸编码权利要求1～3任一项所述的重组抗体。5.根据权利要求4所述的核酸，其特征在于，所述核酸具有SEQIDNO：4和5所示的核苷酸序列。6.一种构建体，其特征在于，所述构建体包括：第一核酸分子，所述第一核酸分子编码抗PD-1的抗体；第二核酸分子，所述第二核酸分子编码人SIRPA胞外段。7.根据权利要求6所述的构建体，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄莺，张发明，席甘，
申请(专利权)人：杭州翰思生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33