一种flagellin-fiber2融合蛋白、其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种flagellin‑fiber2融合蛋白、其制备方法和应用，所述融合蛋白具有较高免疫保护性的禽4型腺病毒fiber2蛋白和鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白的融合蛋白。制备方法是通过将人工编码的flagellin‑fiber2基因融合克隆进pFastBac‑HA表达载体，经基因转座形成重组的Bacmid，随后转染入Sf9昆虫细胞，利用杆状病毒系统表达这个融合蛋白，并通过间接免疫荧光IFA和Western blot进行鉴定。通过上述系统获得重组杆状病毒的周期短，将其flagellin‑fiber2融合蛋白免疫SPF鸡，结果显示杆状病毒系统表达的flagellin‑fiber2融合蛋白具有较高的免疫保护力。

A flagellin-fiber2 fusion protein, its preparation method and Application

The invention provides a flagellin fiber2 fusion protein, a preparation method and application thereof. The fusion protein has high immune protection of avian adenovirus type 4 fiber2 protein and Salmonella typhimurium flagellin fusion protein. The method of preparation is to clone the artificially coded flagellin fiber2 gene into pFastBac_HA expression vector, form recombinant Bacmid by gene translocation, then transfect into Sf9 insect cells, express the fusion protein by baculovirus system, and identify it by indirect immunofluorescence IFA and Western blot. The recombinant baculovirus was immunized to SPF chickens with its flagellin fiber2 fusion protein. The results showed that the flagellin fiber2 fusion protein expressed by the baculovirus system had high immune protection.

【技术实现步骤摘要】
一种flagellin-fiber2融合蛋白、其制备方法和应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一种禽4型腺病毒fiber2蛋白与鼠伤寒沙门氏菌flagellin蛋白的融合蛋白flagellin-fiber2，其制备方法和应用。
技术介绍
禽腺病毒(FowlAdenovirus，FAdV)是腺病毒科禽腺病毒属的成员，是DNA病毒，是禽类及野禽体内常见的传染病病原之一。FAdV可根据群特异性抗原分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三个群。根据交叉中和试验的测定结果，可将Ⅰ群禽腺病毒其分为12个血清型，并且不同的血清型之间具有相同的群抗原。近几年，临床上由Ⅰ亚群禽腺病毒感染而引起鸡的包涵体肝炎(Inclusionbodyhepatitis，IBH)、心包积水综合征(Hydropericardiumsyndrome，HPS)等临床病例显著增多，其中以禽4型腺病毒感染数量居多，主要引起肉鸡、育雏和育成期蛋鸡发病，感染鸡呈急性发病，在不表现任何临床症状的情况下突然死亡，死亡率最高可达到80％。该病具有发病急，易于传播且传播速度快等特点，给养禽业造成巨大的经济损失，已引起世界各地广泛关注。目前防控禽4型腺病毒病的主要方法是接种疫苗，生产中使用的疫苗主要是FAdV-4全病毒灭活疫苗。疫苗对防制禽4型腺病毒病有一定的效果，但该病仍然发生和流行，说明仅能产生体液免疫应答能力的灭活疫苗，不能很好地控制禽4型腺病毒病。体液免疫和细胞免疫在机体的免疫系统中起着重要的作用，而目前使用的灭活疫苗不能刺激机体产生细胞免疫应答，导致防控FAdV-4感染的效果不完美，因此，如何研制出能同时激活体液免疫和细胞免疫应答是FAdV-4疫苗研究的方向。
技术实现思路
为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种flagellin-fiber2融合蛋白，其为具有良好免疫原性和反应性，且没有有安全隐患、并对禽4型腺病毒病具有高免疫保护效果的融合蛋白，上述的flagellin-fiber2融合蛋白是鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白(flagellin)和禽4型腺病毒fiber2蛋白的融合蛋白。为实现上述目的，本专利技术采用以下的技术方案为：一种flagellin-fiber2融合蛋白，其为禽4型腺病毒fiber2蛋白与去除毒力的鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白flagellin融合表达的蛋白。如上所述的flagellin-fiber2融合蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。一种编码上述flagellin-fiber2融合蛋白的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；或所述基因为编码如SEQIDNO.1所示的氨基酸的基因序列进行的替换、添加、缺失一个或多个核苷酸，并具有与SEQIDNO.1所示氨基酸有完整编码基因具有相同功能的核苷酸序列。考虑到密码子的简并性，在不改变基因的编码区氨基酸序列的条件下，或在其非编码区且不影响蛋白表达的条件下，对编码上述蛋白的基因序列进行修改。经大量实验验证，最后将flagellin编码氨基酸的第190-416位氨基酸删除，利用GAPVDPASPW这个短肽序列将flagellin的1-189位和417-508位进行连接，构成重组蛋白中flagellin的序列，获得新的重组基因。因此，本专利技术还包含对编码上述蛋白的基因序列进行的替换、添加、缺失一个或多个核苷酸，并具有与上述完整编码基因具有相同功能的核苷酸序列。一种克隆载体或表达载体，所述克隆载体或表达载体含有如SEQIDNO.2所示的核苷酸序列。一种宿主细胞，所述宿主细胞含如上所述的克隆载体或表达载体。一种如上所述flagellin-fiber2融合蛋白的制备方法，其包括以下步骤：S1、人工合成所述融合蛋白的基因，所述flagellin-fiber2融合蛋白的基因序列编码如SEQIDNO.1所示的氨基酸；S2、将所述融合蛋白的基因连接到pFastBac-HA质粒，得到重组载体pFastBac-HA-flagellin-fiber2；S3、将所述重组载体pFastBac-HA-flagellin-fiber2转化E.coliDH10Bac感受态细胞，利用感受态细胞中的Tn7转座系统，将融合基因转座至杆状病毒穿梭载体Bacmid中，得到重组质粒Bacmid-flagellin-fiber2；S4、将所述重组质粒Bacmid-flagellin-fiber2转染入Sf9昆虫细胞，获得重组杆状病毒，并以Sf9昆虫细胞为宿主细胞培养病毒，采用Ni-NAT亲和层析法纯化带有His标签的目的蛋白。如上所述的制备方法，优选地，在步骤S1中，所述flagellin-fiber2融合蛋白的基因序列如SEQIDNO.2所示；如上所述的制备方法，优选地，在步骤S2中，将所述融合蛋白的基因连接到pFastBac-HA质粒的操作为：S201、先采用如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所述的引物扩增步骤(1)人工合成的所述融合蛋白的基因，纯化扩增产物；S202、用限制性内切酶NotI和HindIII对载体pFastBac-HA和纯化后的PCR产物进行双酶切，16℃连接过夜，转化入DH5α感受态细胞，挑取PCR鉴定为阳性的单菌落摇菌提质粒，获得阳性pFastBac-HA重组质粒pFastBac-HA-flagellin-fiber2。如上所述的制备方法，优选地，在步骤S3中，所述转化E.coliDH10Bac感受态细胞的鉴定，采用的引物如SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示的序列。如上所述的制备方法，优选地，在步骤S4中，所述目的蛋白的分子量为100kD。如上所述flagellin-fiber2融合蛋白的应用，所述flagellin-fiber2融合蛋白用于制备防控禽4型腺病毒病的疫苗。本专利技术的有益效果在于：本专利技术提供的flagellin-fiber2融合蛋白中的鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白(flagellin)作为TLR5的识别配体，诱导产生天然免疫应答。鞭毛蛋白可通过自身诱导的先天性免疫系统产生的应答来启动并增强特异性免疫系统对其它与鞭毛蛋白融合的蛋白抗原产生特异性的应答，发挥较强的免疫佐剂作用。本专利技术提供的融合蛋白中的fiber2蛋白是FAdV-4主要免疫原性结构蛋白，是FAdV-4的保护性抗原，其诱导的抗体能保护宿主不受FAdV-4的感染。可见，本专利技术提供的融合蛋白中鞭毛蛋白以佐剂的形式增强机体对fiber2蛋白的免疫应答，具有更好的保护作用。此外，本专利技术研究发现，利用杆状病毒表达系统表达的融合蛋白flagellin-fiber2表现出良好的免疫保护力。本专利技术是通过杆状表达系统将鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白与禽4型腺病毒fiber2蛋白进行融合表达，由于利用的表达系统属于真核表达系统，因此表达产物具有与天然蛋白近似的理化和生物学特性，能进行蛋白翻译后的加工修饰，融合蛋白表达稳定且具有良好的免疫原性，对实验动物进行强毒攻击后有较好的免疫保护力。本专利技术提供的一种flagellin-fiber2融合蛋白，其具有良好免疫原性和反应性，对禽4型腺病毒感染的疾病具有高免疫保护效果，安全性高。本专利技术还提供了flagellin-fiber2融合蛋白的氨基酸序列和基因编码序列信息，为稳定表达和增加表达产率提供了基础。附图说明图1为目的基因扩增结果，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种flagellin‑fiber2融合蛋白，其特征在于，其为禽4型腺病毒fiber2蛋白与去除毒力的鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白flagellin融合表达的蛋白。

【技术特征摘要】
1.一种flagellin-fiber2融合蛋白，其特征在于，其为禽4型腺病毒fiber2蛋白与去除毒力的鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白flagellin融合表达的蛋白。2.根据权利要求1所述的flagellin-fiber2融合蛋白，其特征在于，所述flagellin-fiber2融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。3.一种编码权利要求1或2所述的flagellin-fiber2融合蛋白的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；或所述基因为编码如SEQIDNO.1所示的氨基酸的基因序列进行的替换、添加、缺失一个或多个核苷酸，并具有与SEQIDNO.1所示氨基酸有完整编码基因具有相同功能的核苷酸序列。4.一种克隆载体或表达载体，其特征在于，所述克隆载体含有如SEQIDNO.2所示的核苷酸序列。5.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有如SEQIDNO.2所示的核苷酸序列。6.一种flagellin-fiber2融合蛋白的制备方法，其包括以下步骤：S1、人工合成flagellin-fiber2融合蛋白的基因，所述flagellin-fiber2融合蛋白的基因序列编码如SEQIDNO.1所示的氨基酸；S2、将所述融合蛋白的基因连接到pFastBac-HA质粒，得到重组载体pFastBac-HA-flagellin-fiber2；S3、将所述重组载体pFastBac-HA-flagellin-fiber2转化E.coliDH10Bac感受态细胞，利用感受态细胞中Tn7转座系统，将融合基因转座至杆状病毒穿梭载体Bacmid中，得到重组质粒Bac...

【专利技术属性】
技术研发人员：侯磊，刘爵，韦莉，王菁，全荣，朱珊珊，
申请(专利权)人：北京市农林科学院，
类型：发明
国别省市：北京,11