一种特异性检测多硫化物的蛋白荧光探针及其制备方法与应用技术

本发明专利技术涉及一种特异性检测多硫化物的蛋白荧光探针及其制备方法与应用。本发明专利技术中蛋白荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，是基于绿色荧光蛋白基因定点突变改造而成的，还提供了该蛋白荧光探针的制备方法。本发明专利技术中蛋白荧光探针制备方法简单，选择性高，检测方法简单，检测限低，灵敏度高，抗干扰能力强，数据计算方便。本发明专利技术中特异性检测多硫化物的蛋白荧光探针还可以实现活细胞和亚细胞器水平上的多硫化物的检测，细胞器定位准确，能够实时准确定量细胞器的多硫化物，为研究细胞内和细胞器内的多硫化物水平提供了有利的工具。

A Protein Fluorescent Probe for Specific Detection of Polysulfide and Its Preparation and Application

The invention relates to a protein fluorescent probe for specific detection of polysulfides, a preparation method and application thereof. The nucleotide sequence of the protein fluorescent probe in the invention, as shown in SEQ ID NO.1, is modified based on site mutation of the green fluorescent protein gene, and the preparation method of the protein fluorescent probe is also provided. The protein fluorescent probe in the invention has the advantages of simple preparation method, high selectivity, simple detection method, low detection limit, high sensitivity, strong anti-interference ability and convenient data calculation. The protein fluorescent probe for the specific detection of polysulfides in the present invention can also realize the detection of polysulfides at the level of living cells and suborganelles. The location of organelles is accurate, and the polysulfides in organelles can be quantified accurately in real time. It provides a useful tool for the study of polysulfides levels in cells and organelles.

【技术实现步骤摘要】
一种特异性检测多硫化物的蛋白荧光探针及其制备方法与应用
本专利技术涉及一种特异性检测多硫化物的蛋白荧光探针及其制备方法与应用，属于生物

技术介绍
多硫化物(polysulfides,HSnH,RSnH,n≥2；RSnR,n≥3)是近年来被发现的一类广泛存在于原核和真核细胞内的含硫化合物，在生理活动中起着很重要的作用，包括诱导Ca2+代谢流、肿瘤抑制因子磷酸化酶的调控、维持胞内的氧化还原状态等，也是线粒体功能的潜在调节因子。细胞内超过40％的蛋白通过自身的巯基化修饰参与胞内的代谢功能，而高水平的多硫化物既可以维持蛋白的过硫化修饰，又可以增强细胞的抗氧化作用。中国专利文献CN107290323A公开了一种近红外荧光探针及其制备方法与应用技术，涉及一种新型的近红外荧光探针及其制备方法与在检测多硫化物中的应用，所述方法包括通过尼罗红衍生物与2-氟-4-硝基苯甲酸反应得到所述探针分子。该探针制备方法简单、结构稳定，通过荧光分光光度计可用于高选择性、高灵敏度、快速地检测二硫化钠。该近红外荧光探针为化学制剂，适宜于体外检测多硫化物，但是无法实时定量检测生物体内的多硫化物水平，又可能会对生物体造成不可逆的伤害。目前对于多硫化物的研究进展相对缓慢，原因之一是没有合适的可以在细胞内定位并进行实时定量多硫化物水平的方法。因此构建高效、高选择性、高灵敏性和短时间响应定量检测多硫化物的方法是人们目前亟待解决的问题。绿色荧光蛋白(Greenfluorescentproteins，GFP)是一类重要的指示蛋白，通过一定的激发光激发时可发射出绿色荧光以便于检测。通过基因工程，绿色荧光蛋白(GFP)基因能够稳定转化进不同物种的基因组，在后代中持续表达。现在，绿色荧光蛋白(GFP)基因已被导入并表达在许多物种，包括细菌，酵母和其他真菌，鱼(例如斑马鱼)，植物，苍蝇，甚至人等的哺乳动物细胞。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种特异性检测多硫化物的蛋白荧光探针及其制备方法与应用。本专利技术通过定点突变改变绿色荧光蛋白roGFP氨基酸序列中两个半胱氨酸之间的距离获得蛋白荧光探针psGFP，使得该蛋白荧光探针能够特异性的检测多硫化物，并能够实现在细胞内不同细胞器的定位，实时的动态监测胞内多硫化物浓度水平的变化。术语说明：H2Sn(HSSH)：多硫化物的一种，n≥2，n为整数。roGFP：全称为redoxsensitiveversionsofGFP，即氧化还原敏感的绿色荧光蛋白，为绿色荧光蛋白中的一种。本专利技术的技术方案如下：一种特异性检测多硫化物的蛋白荧光探针，所述蛋白荧光探针的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。根据本专利技术优选的，所述蛋白荧光探针是基于绿色荧光蛋白roGFP基因定点突变而得，所述定点突变是将roGFP氨基酸序列中第202位的丝氨酸突变为半胱氨酸，第204位的半胱氨酸突变为丝氨酸。上述特异性检测多硫化物的蛋白荧光探针的制备方法，步骤如下：(1)以绿色荧光蛋白基因为模板，定点突变构建得蛋白荧光探针的基因序列，去掉起始密码子atg后插入到表达载体pET30的多克隆位点上，获得N端带有6-his标签的蛋白荧光探针的表达载体pET30-psGFP；所述蛋白荧光探针的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；(2)将步骤(1)获得的表达载体pET30-psGFP转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，获得重组表达大肠杆菌；(3)将步骤(2)获得的重组表达大肠杆菌进行培养，IPTG诱导表达蛋白荧光探针，并对重组表达大肠杆菌细胞进行裂解，利用his标签进行蛋白纯化，即得特异性检测多硫化物的蛋白荧光探针。根据本专利技术优选的，步骤(1)中所述绿色荧光蛋白为roGFP，所述定点突变是将roGFP氨基酸序列中第202位的丝氨酸突变为半胱氨酸，第204位的半胱氨酸突变为丝氨酸。上述特异性检测多硫化物的蛋白荧光探针在检测体外多硫化物中的应用。根据本专利技术优选的，所述应用，方法如下：将上述特异性检测多硫化物的蛋白荧光探针与二巯基苏糖醇完全反应，脱盐后得还原态蛋白荧光探针，将还原态蛋白荧光探针与多硫化物样品混合反应后脱盐，采用荧光分光光度计对反应液中蛋白荧光探针的荧光强度进行扫描，激发光谱Ex分别设定为408nm和488nm，发射光谱Em设定为510nm，记录两个不同激发光谱的Em510数据，并计算Ex为408nm时Em510和Ex为488nm时Em510的比值，比值越高，说明多硫化物的浓度越高。进一步优选的，所述脱盐采用脱盐柱脱盐。进一步优选的，所述混合反应的条件为冰浴反应30-50min。进一步优选的，所述多硫化物样品为H2Sn或谷胱甘肽过硫化物(GSSH)。进一步优选的，所述多硫化物样品的检测浓度的10-170μM，所述反应液中蛋白荧光探针的工作浓度为0.01-0.1mg/mL。上述特异性检测多硫化物的蛋白荧光探针在检测酿酒酵母体内多硫化物中的应用。根据本专利技术优选的，所述应用为以下之一项或多项：i.在检测酿酒酵母细胞质内多硫化物中的应用，步骤如下：将上述蛋白荧光探针的基因序列插入到表达载体YEPlac195上，所述蛋白荧光探针的启动子是TEF1，构建得酿酒酵母表达载体YEPlac195-psGFP；将酿酒酵母表达载体YEPlac195-psGFP转化到酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中，获得在酿酒酵母细胞质中定位的蛋白荧光探针，诱导表达后进行酿酒酵母细胞质内多硫化物的检测；ii.在检测酿酒酵母线粒体内多硫化物中的应用，步骤如下：将上述蛋白荧光探针的基因序列插入到表达载体YEPlac195上，所述蛋白荧光探针的启动子是TEF1，构建得酿酒酵母表达载体YEPlac195-psGFP；将线粒体的定位信号肽插入到上述酿酒酵母表达载体YEPlac195-psGFP的N端，得到酿酒酵母线粒体定位表达载体YEPlac195–psGFP–Mito；将酿酒酵母线粒体定位表达载体YEPlac195–psGFP–Mito转化到酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中，获得在酿酒酵母线粒体中定位的蛋白荧光探针，诱导表达后进行酿酒酵母线粒体内多硫化物的检测；所述线粒体的定位信号肽的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示；iii.在检测酿酒酵母过氧化物酶体内多硫化物中的应用，步骤如下：将上述蛋白荧光探针的基因序列插入到表达载体YEPlac195上，所述蛋白荧光探针的启动子是TEF1，构建得酿酒酵母表达载体YEPlac195-psGFP；将过氧化物酶体的定位信号肽插入到上述酿酒酵母表达载体YEPlac195-psGFP的N端，得到酿酒酵母过氧化物酶体定位表达载体YEPlac195–psGFP–SKL；将酿酒酵母过氧化物酶体定位表达载体YEPlac195–psGFP–SKL转化到酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中，获得在酿酒酵母过氧化物酶体中定位的蛋白荧光探针，诱导表达后进行酿酒酵母过氧化物酶体内多硫化物的检测；所述氧化物酶体的定位信号肽SEQIDNO.3所示。进一步优选的，所述多硫化物的检测，方法如下：取诱导表达后的酿酒酵母培养液，离心收集菌体，PBS缓冲液洗涤并重悬得待检测样品，采用荧光分光光度计对待本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种特异性检测多硫化物的蛋白荧光探针，其特征在于，所述蛋白荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种特异性检测多硫化物的蛋白荧光探针，其特征在于，所述蛋白荧光探针的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。2.如权利要求1所述的蛋白荧光探针，其特征在于，该蛋白荧光探针是基于绿色荧光蛋白roGFP基因定点突变而得，所述定点突变是将roGFP氨基酸序列中第202位的丝氨酸突变为半胱氨酸，第204位的半胱氨酸突变为丝氨酸。3.权利要求1所述的特异性检测多硫化物的蛋白荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤如下：(1)以绿色荧光蛋白基因为模板，定点突变构建得蛋白荧光探针的基因序列，去掉起始密码子atg后插入到表达载体pET30的多克隆位点上，获得N端带有6-his标签的蛋白荧光探针的表达载体pET30-psGFP；所述蛋白荧光探针的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；(2)将步骤(1)获得的表达载体pET30-psGFP转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，获得重组表达大肠杆菌；(3)将步骤(2)获得的重组表达大肠杆菌进行培养，IPTG诱导表达蛋白荧光探针，并对重组表达大肠杆菌细胞进行裂解，利用his标签进行蛋白纯化，即得特异性检测多硫化物的蛋白荧光探针。4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述绿色荧光蛋白为roGFP，所述定点突变是将roGFP氨基酸序列中第202位的丝氨酸突变为半胱氨酸，第204位的半胱氨酸突变为丝氨酸。5.权利要求1所述的特异性检测多硫化物的蛋白荧光探针在检测体外多硫化物中的应用，方法如下：将权利要求1所述的特异性检测多硫化物的蛋白荧光探针与二巯基苏糖醇完全反应，脱盐后得还原态蛋白荧光探针，将还原态蛋白荧光探针与多硫化物样品混合反应后脱盐，采用荧光分光光度计对反应液中蛋白荧光探针的荧光强度进行扫描，激发光谱Ex分别设定为408nm和488nm，发射光谱Em设定为510nm，记录两个不同激发光谱的Em510数据，并计算Ex为408nm时Em510和Ex为488nm时Em510的比值，比值越高，说明多硫化物的浓度越高。6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述方法包括以下条件中的一项或多项：1)所述脱盐采用脱盐柱脱盐；2)所述混合反应的条件为冰浴反应30-50min；3)所述多硫化物样品为H2Sn或谷胱甘肽过硫化物；4)所述多硫化物样品的检测浓度的10-170μM，所述反应液中蛋白荧光探针的工作浓度为0.01-0.1mg/mL。7.权利要求1所述的特异性检测多硫化物的蛋白荧光探针在检测酿酒酵母体内多硫化物中的应用。8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用为以下之一项或多项：i.在检测酿酒酵母细胞质内多硫化物中的应用，步骤如下：将权利要求1所述的蛋白荧光探针的基因序列插入到表达载体YEPlac195上，所述蛋白荧光探针的启动子是T...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘怀伟，荀鲁盈，李焕杰，胡欣，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：山东,37