一种改良的亚稳定态牛呼吸道合胞病毒融合前体F蛋白质及编码的DNA分子和其应用制造技术

本发明专利技术属于生物技术领域，公开了一种经过基因改良的亚稳定态的牛呼吸道合胞病毒融合前体F蛋白质、编码的DNA分子及其应用。本发明专利技术将结构生物学的方法应用到疫苗设计和改良中，通过对牛呼吸道合胞病毒F蛋白质三维结构的观察，发现其发生构象变化的生物学机制。在F蛋白质三维结构的基础上进行抗原设计和基因工程改造，获得保持在亚稳定态F蛋白质融合前体的牛呼吸道合胞病毒F蛋白质疫苗。在此蛋白质疫苗基础上进行基因工程改造，构建可以在细胞表面表达牛呼吸道胞合体病毒F蛋白融合前体蛋白质的质粒做为DNA疫苗，使接受免疫动物获得良好的保护。通过分子生物学，生物学，细胞生物学，免疫学的方法确定了疫苗的稳定性，有效性和安全性。

A Modified Metastable Bovine Respiratory Syncytial Virus Fusion Precursor F Protein and Coded DNA Molecule and Its Application

The invention belongs to the field of biotechnology, and discloses a metastable bovine respiratory syncytial virus fusion precursor F protein, coded DNA molecule and its application after gene modification. The method of structural biology is applied to vaccine design and improvement. The biological mechanism of conformation change of bovine respiratory syncytial virus F protein is found by observing its three-dimensional structure. Based on the three-dimensional structure of F protein, antigen design and genetic engineering were carried out to obtain bovine respiratory syncytial virus F protein vaccine, which maintained the precursor of metastable F protein fusion. On the basis of this protein vaccine, genetic engineering was carried out to construct a plasmid which can express bovine respiratory syncytial virus F protein fusion precursor protein on the cell surface as a DNA vaccine, so that immunized animals can get good protection. The stability, efficacy and safety of the vaccine were determined by molecular biology, biology, cell biology and immunology.

【技术实现步骤摘要】
一种改良的亚稳定态牛呼吸道合胞病毒融合前体F蛋白质及编码的DNA分子和其应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一种牛呼吸道合胞病毒融合前体F蛋白质及所述蛋白质编码的DNA分子和其应用。
技术介绍
牛呼吸道合胞病毒(BovineRespiratorySyncytialVirus,BRSV)主要引起2～6月龄犊牛的细支气管炎和间质性肺炎。即使存在中等水平的母牛抗体，出生后第一年犊牛的患病率仍可高达50％以上。尽管市场上已有多种获得许可的BRSV灭活，弱毒疫苗。但由于这些疫苗的稳定性和对动物的保护率低等原因，目前尚没有理想的疫苗可供使用。虽然BRSV致死率不高，但因其并发症导致的无法逆转的肺部和呼吸道伤害及治疗费用、饲养成本的增加会给养牛业造成严重的经济损失。仅2015年美国当年损失接近10亿美元。国内相关的数据未见报道，但是2017年国内牛的存栏数近一亿头，略高于美国的数量。RSV属于副粘病毒科、肺炎病毒属中的成员，其基因组为非节段的单负链RNA，由15225个核苷酸组成。RSV基因组编码主要有11种蛋白质，基因组从3'至5'端编码的蛋白依次为NSl、NS2、N、P、M、SH、G、F、M2(M2-l、M2-2)和L等，其中表面蛋白糖蛋白G和融合蛋白F在病毒囊膜表面形成刺突。RSV感染宿主细胞时，需要病毒膜与寄主细胞膜发生融合。基于当前对副黏液病毒发生融合的研究，RSVF蛋白质最初形成时折叠成一种"融合前"构象(Pro-fusion)。在两者的膜发生融合时，该融合前体的构象进行再折叠和构象变化成为"融合后"构象(Post-fusion)。因此，该RSVF融合前体蛋白的是一种亚稳定态的蛋白质，它通过最初折叠成一种亚稳形式(融合前构象)，该亚稳形式随后进行不连续，逐步和不可逆的构象变化成一个较低能量稳定态的构象(融合后构象)。构象变化的生物学机制在于病毒通过F蛋白的构象变化介导病毒和宿主细胞膜发生融合，致使病毒的遗传物质侵入宿主细胞内，借助宿主细胞系统完成病毒的复制。所以F蛋白融合前体是最佳的疫苗候选物，是主要中和抗原成分。机体感染RSV后，病毒编码的F和G抗原蛋白能刺激机体免疫应答，产生血清IgG中和抗体和呼吸道黏膜的分泌型IgA抗体，在抗RSV感染具有重要作用。但是问题在于天然的F蛋白融合前体很不稳定。这也是使用传统的灭活和减毒的方法无法获得长期有效和稳定的疫苗的原因。需要对其进行构象稳定化的改良。使用电子显微镜技术对RSVF蛋白进行观察的结果显示融合前与融合后三聚体之间存在巨大的结构差异。这些结构的变化也通过蛋白质结晶学方法得到了确认McLellanJ.S.etal.Science.136(2013)和McLellanJ.S.etal.158(2013)。动物实验的结果显示融合前和融合后RSVF蛋白质在抗原性上是独特的CalderL.J.etal.Virology271(2000)。人类呼吸道合胞病毒(HumanRespiratorySyncytialVirus,HRSV)与牛呼吸道合胞病毒具有遗传相似性，可高达85％。人类RSV是儿童出生后第一年毛细支气管炎和肺炎的最常见原因。RSV还可引起反复感染，包括严重的下呼吸道疾病，这可能发生在任何年龄，特别是老年人或心脏，肺部或免疫系统受损的人。每年有4300万人幼儿和老年人的因严重呼吸道疾病导致住院治疗。相关的HRSV疫苗已经在小鼠，棉鼠和非人灵长类动物(NHP)动物模型中进行了评估。但是上个世纪七十年代Merck公司研发的灭活hRSV疫苗临床实验造成了受试婴儿死亡的重大事故。2013年美国国立卫生研究院疫苗研究中心将结构生物学的方法应用疫苗研发的领域。他们的基于蛋白质原子结构设计的亚稳态融合前(F)糖蛋白质(Pre-fusionF)疫苗候选物在临床前非人灵长类动物实验中取得了良好的结果。目前这种人类RSV疫苗已经进入了临床I期阶段。(参见例如WO20101149745、WO2010/1149743、WO2009/1079796、WO2012/158613)。将这些疫苗设计转化为牛背景的疫苗候选物在理化学，生物学及犊牛动物实验中也显示了非常好的前景。然而，他们改良的疫苗在产量和抗原活性上仍有可改良的空间。目前国外市场上有几种已经被认可使用的bRSV疫苗。这些传统疫苗的研制和生产方式主要是通过改变培养条件，或在不同培养细胞上传代使致病微生物毒性减弱的减毒疫苗，如(ZOETIS,Bovi-ShieldGold5,SKU:540492)。它们的缺点在于有效期短，保护率低。这类疫苗的局限性还表现在：(1)动物和人类的病毒需要在动物细胞中培养，这使得疫苗生产的成本很高；(2)疫苗中的致病物质在疫苗生产过程中有可能没有充分减毒，这会导致疫苗中含有强毒性致病物质，进而使得疾病在更大的范围内传播；(3)减毒菌株有可能会发生突变，引起病害。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于针对现有疫苗存在的问题，提供一种构象稳定的牛呼吸道合胞病毒F蛋白的融合前体蛋白、编码所述蛋白的DNA及其应用。为实现本专利技术的目的，本专利技术采用如下技术方案：一种牛呼吸道合胞病毒F蛋白的融合前体蛋白，包含至少一处选自下组的对F蛋白野生型的改造：A、增加F蛋白三聚体每个单体内部以及单体之间二硫键的连接数量；B、突变F蛋白三聚体内部至少一个氨基酸，将侧链较小的氨基酸突变成为侧链较大的氨基酸或增加内部的疏水结合；C、突变剔除至少一个蛋白酶的酶切位点；D、切除F蛋白三聚体至少一个动态较大氨基酸，代之以较短的连接肽；E、在F-蛋白质的C-终端延长螺旋构造。作为优选，所述对F蛋白野生型的改造包含第143位甘氨酸、第404位丝氨酸、第103位丝氨酸、第262位丝氨酸突变为半胱氨酸，第288位异亮氨酸突变为苯丙氨酸，第187位缬氨酸突变为亮氨酸。更优选地，所述牛呼吸道合胞病毒F蛋白的融合前体蛋白在下述三种设计改造下抗原的产量、稳定性及与特异抗体结合的亲和力有较好的表现：1)M1设计：第159位组氨酸、第291位缬氨酸突变为半胱氨酸，剪除从109至137氨基酸序列，加入连接肽丝氨酸－谷氨酸－丝氨酸－丝氨酸－谷氨酸－丝氨酸－丝氨酸－谷氨酸；简写为H159C，V291C；G143C，S404C；S103C，S262C；I288F；V187L；Δ109-137(SGSSGSSG)；2)M2设计：第158位亮氨酸、第290位丝氨酸突变为半胱氨酸，剪除从114至132氨基酸序列，加入连接肽丝氨酸－谷氨酸－丝氨酸－丝氨酸－谷氨酸；简写为L158C，S290C；G143C，S404C；S103C，S262C；I288F；V187L；Δ114-132(SGSSG)；3)M3设计：第158位亮氨酸、第290位丝氨酸突变为半胱氨酸，剪除从114至132氨基酸序列，加入连接肽丝氨酸－谷氨酸－丝氨酸－丝氨酸－谷氨酸－丝氨酸－丝氨酸－谷氨酸；简写为L158C，S290C；G143C，S404C；S103C，S262C；I288F；V187L；Δ109-137(SGSSGSSG)。不同病毒株的牛呼吸道胞合体病毒F蛋白质的基因序列不同，改造后的牛呼吸道合胞病毒F蛋白的融合前体蛋白的序列也就不同。进一步的，牛呼吸道合胞病毒F蛋白的融合前体蛋白本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种牛呼吸道合胞病毒F蛋白的融合前体蛋白，包含至少一处选自下组的对野生型F蛋白的改造：A、增加F蛋白三聚体每个单体内部以及单体之间二硫键的连接数量；B、突变F蛋白三聚体内部至少一个氨基酸，将侧链较小的氨基酸突变成为侧链较大的氨基酸或增加内部的疏水结合；C、突变剔除至少一个蛋白酶的酶切位点；D、切除F蛋白三聚体至少一个动态较大氨基酸，代之以较短的连接肽；E、延长F‑蛋白质的C‑终端阿尔法(α)螺旋构造。

【技术特征摘要】
1.一种牛呼吸道合胞病毒F蛋白的融合前体蛋白，包含至少一处选自下组的对野生型F蛋白的改造：A、增加F蛋白三聚体每个单体内部以及单体之间二硫键的连接数量；B、突变F蛋白三聚体内部至少一个氨基酸，将侧链较小的氨基酸突变成为侧链较大的氨基酸或增加内部的疏水结合；C、突变剔除至少一个蛋白酶的酶切位点；D、切除F蛋白三聚体至少一个动态较大氨基酸，代之以较短的连接肽；E、延长F-蛋白质的C-终端阿尔法(α)螺旋构造。2.根据权利要求1所述的融合前体蛋白，所述改造包含第143位甘氨酸、第404位丝氨酸、第103位丝氨酸、第262位丝氨酸突变为半胱氨酸，第288位异亮氨酸突变为苯丙氨酸，第187位缬氨酸突变为亮氨酸。3.根据权利要求2所述的融合前体蛋白，还包含下述改造中的一种：1)第159位组氨酸、第291位缬氨酸突变为半胱氨酸，剪除从109至137氨基酸序列，加入连接肽丝氨酸－谷氨酸－丝氨酸－丝氨酸－谷氨酸－丝氨酸－丝氨酸－谷氨酸；2)第158位亮氨酸、第290位丝氨酸突变为半胱氨酸，剪除从114至132氨基酸序列，加入连接肽丝氨酸－谷氨酸－丝氨酸－丝氨酸－谷氨酸；3)第158位亮氨酸、第290位丝氨酸突变为半胱氨酸，剪除从114至132氨基酸序列，加入连接肽丝氨酸－...

【专利技术属性】
技术研发人员：周建国，戴敏，
申请(专利权)人：苏州宇之波生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32