本专利涉及一种EV71单链DNA适配体及利用双适配体检测肠道病毒71型的化学发光检测试剂盒。所述适配体是序列如SEQ ID NO.1的适配体V11、序列如SEQ ID NO.2适配体V21，以及序列如SEQ ID NO.3适配体V7。本发明专利技术试剂盒，是以适配体V21为捕获探针，以适配体V11为信号探针。具体包括：捕获探针偶联的免疫磁珠、分析缓冲液、信号探针偶联的酶结合物、SA‑HRP溶液、发光底物液。本试剂盒对EV71的检测有高度的特异性；能从疑似手足口病患者的脑脊液、疱疹液、咽拭子和肛拭子等标本中定性检测EV71；利用本发明专利技术试剂盒检测操作简单快速，检测过程仅需45分钟左右。
Single-stranded DNA aptamer of EV71 and chemiluminescence kit for detection of enterovirus 71 by double-aptamer
The patent relates to an EV71 single-stranded DNA adapter and a chemiluminescence detection kit for detection of enterovirus 71 using double adapters. The adapter is an adapter V11 of a sequence such as SEQ ID NO.1, a sequence such as SEQ ID NO.2 adapter V21, and a sequence such as SEQ ID NO.3 adapter V7. The kit of the invention takes the adapter V21 as the capture probe and the adapter V11 as the signal probe. Specifically, it includes: capturing probe-coupled immunomagnetic beads, analyzing buffer, signal probe-coupled enzyme conjugates, SA HRP solution, and luminescent substrate solution. The kit has high specificity for the detection of EV71; it can qualitatively detect EV71 from cerebrospinal fluid, herpes fluid, pharyngeal swab and anal swab of suspected HFMD patients; and the detection operation is simple and fast, and the detection process only takes about 45 minutes.
【技术实现步骤摘要】
EV71单链DNA适配体及利用双适配体检测肠道病毒71型的化学发光检测试剂盒
本专利技术涉及针对EV71的单链DNA适配体，以及利用双适配体检测肠道病毒71型(EV71)的化学发光试剂盒及其应用，适用于EV71病毒定性检测。
技术介绍
手足口病(Hand，footandmouthdisease,HFMD)是由肠道病毒引起的传染病，近年来各地均有散在发生。该病常见于学龄前儿童，婴幼儿多见，可引起发热和手、足、口腔等部位的皮疹、溃疡，一般预后良好，个别患者可引起心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜脑炎等并发症。手足口病的传染源为病人和隐性感染者，主要是通过密切接触感染者的粪便、口腔分泌物、皮肤疱疹液中的病毒，经粪－口途径或呼吸道(主要是口腔粘膜和鼻腔粘膜)传播。肠道病毒71型是引起手足口病的最主要病原体之一，且引发重症感染的比例较大，病死率也较高。因此，对可引起重症手足口病的对于疾病的控制和治疗非常重要。现EV71的检测主要是荧光定量PCR技术，其操作较繁琐，且费用昂贵，亟待有更好的检测方法。核酸适配体是一段经体外筛选得到的寡核苷酸序列,能与相应的配体进行高亲和力和强特异性的结合，利用适配体技术建立检测方法具有极大的应用价值。但是，至今还没有基于适配体技术检测EV71的相关报道。本专利技术以磁珠为载体使用两条不同的适配体分别用于捕获EV71和信号转换构建了磁珠-适配体1-EV71-适配体2-辣根过氧化物酶的三明治结构的适配体生物传感器，经过筛选得到的适配体能特异性的结合样本中的EV71病毒，无需对样本提取核酸或做预处理，通过发光值，直接得到对样本的定性检测结果。专利技术内容本专利技术的目的是提供一种EV71的核酸适配体及筛选方法及适配体技术的检测EV71的化学发光试剂盒。本专利技术是利用SELEX技术筛选出能够与EV71结构结构蛋白特异性和高亲和力结合的单链DNA核酸适配体序列，并利用得到的核酸适配体构建能够对EV71进行高灵敏和高特异性检测的化学发光试剂盒。该试剂盒能快速准确的对待测样品中的EV71进行定性检测。该方法可用全自动化学发光仪完成检测，检测时长约45分钟。一种EV71单链DNA双适配体，其特征在于，所述双适配体是序列如SEQIDNO.1的适配体V11、序列如SEQIDNO.2的适配体V21、或序列如SEQIDNO.3的适配体V7。本专利技术提供了一种EV71的单链DNA适配体的筛选及选择及应用其化学发光检测方法。包括以下步骤：步骤一：利用EV71结构蛋白来筛选EV71的单链DNA适配体；步骤二：对筛选得到的核酸序列进行TA克隆和测序；步骤三：对筛选得到的适配体进行亲和性和特异性检测；步骤四：利用亲和性最高的两条适配体构建两种双适配体的化学法光EV71检测方法，进行比较。步骤五：选择较优的双适配体化学发光EV71检测方法用于设计EV71化学发光定性试剂盒。本专利技术经SELEX技术筛选，得到的适配体序列分别为，V11(SEQIDNO.1):5’-actaagccaccgtgtccacccUcgccgagUUUUcgUaacUaUaUcUUgUggUUccUaUUgcUgcgUcacUcUggaU-3’；V21(SEQIDNO.2):5’-actaagccaccgtgtccaUUcgaUUcgaUcUaaUUUggUUcUUUccUcacUUUUcagUgcUgcgUcacUcUggaU-3’。V7(SEQIDNO.3):5’-ctaagccaccgtgtccaUcaaUggUgUgUgcaUUcgUgUgUUgUgUUgUUUgUUgUUUgcUgcgUcacUcUggaU-3’；通过ELISA对得到的三条适配体(V7、V11、V21)进行亲和性测试，分别为32.72nM、4.28nM、4.55nM。故选择对EV71结构蛋白亲和性更高的V11及V21用于设计EV71的双适配体化学发光检测方法。分别构建以V21为捕获探针，V11为信号探针及V11为捕获探针，V21为信号探针的EV71的双适配体化学发光检测方法，发现以V21为捕获探针，V11为信号探针的EV71检测方法具有更高的信噪比，故采用V21为捕获探针，V11为信号探针来构建EV71的化学发光定性试剂盒。本专利技术所说的检测EV71的化学发光定性试剂盒，其适配体1(捕获探针)为适配体V21，适配体2(信号探针)为适配体V11。具体地，一种双适配体检测EV71的化学发光试剂盒，包括：(1)捕获探针偶联的免疫磁珠；(2)分析缓冲液；(3)信号探针偶联的酶结合物；(4)SA-HRP溶液；(5)发光底物液。各成分具体是：(1)捕获探针偶联的免疫磁珠:表面固定有适配体V21的免疫磁珠，用于捕获样本中的EV71病毒；(2)分析缓冲液：1xPBS，5mMMgCl2，0.02％tween-20；(3)信号探针溶液：1xPBS，500nM适配体V11，5mMMgCl2，1％BSA，1μg/mltRNA，0.02％tween-20，(4)SA-HRP溶液：SA-HRP：分析缓冲液1:1000；(5)发光底物液：辣根过氧化物酶作用的发光底物液，包括鲁米诺和过氧化氢溶液。利用本专利技术的化学发光EV71试剂盒检测样本中的EV71，可以快速的得到样品中EV71的大致含量，对指导疾病控制人员的相关卫生防疫工作，帮助临床医生更好的掌握对EV71感染手足口病的治疗、预后和转归有重要意义。本专利技术的有益效果主要体现在：(1)本专利技术中筛选得到的适配体均对EV71结构蛋白具有高度的亲和性(解离常数Kd分别在nM范围)。(2)本试剂盒对EV71的检测有高度的特异性，与其他肠道病毒无明显交叉反应；检测的灵敏度达103拷贝数，可直接从疑似手足口病患者的脑脊、疱疹液、咽拭子和肛拭子等标本中检测EV71结构；利用本专利技术试剂盒检测操作简单快速，检测过程仅需45分钟左右，且该试剂盒的检测过程可以通过自动化仪器实现。附图说明图1是适配体筛选过程中的测序结果图2是适配体V7的亲和力结果图3是适配体V11的亲和力结果图4是适配体V21的亲和力结果图5是适配体V7、V11、V21的特异性结果图6是适配体化学发光检测方法原理示意图图7是捕获探针及信号探针选择的实验结果具体实施方式下面结合具体实施例,进一步阐述本专利技术。这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术要求保护的范围，下列实施例中未注明具体实验条件和方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。实施例1：EV71适配体的筛选：1)主要试剂：BindingBuffer：1*PBS，5mMMgCl2，1％BSA，1μg/mltRNA，0.02％tween-20，5mM咪唑WashingBuffer：1*PBS，5mMMgCl2，0.02％tween-20表1筛选库和引物序列2)第一轮SELEXa.library加水溶解至终浓度20μM。b.配置延伸体系延伸程序如下：95℃60s，58℃60s，72℃60minc.产物加入SAagarosebead室温孵育10min，洗去未结合序列。d.加入150mMNaOH室温孵育5min，吸取上清，加入300mMHCl中和。e.以水为对照，Nanodrop测定修饰单链DNA浓度。f.95℃变性5min，冰浴后加入BindingBuffer本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种针对EV71的单链DNA适配体，其特征在于，所述适配体是序列如SEQ ID NO.1的适配体V11、序列如SEQ ID NO.2的适配体V21，以及序列如SEQ ID NO.3的适配体V7。
【技术特征摘要】
1.一种针对EV71的单链DNA适配体，其特征在于，所述适配体是序列如SEQIDNO.1的适配体V11、序列如SEQIDNO.2的适配体V21，以及序列如SEQIDNO.3的适配体V7。2.一种双适配体检测EV71的化学发光试剂盒，其特征在于，以序列如SEQIDNO.2的适配体V21为捕获探针，以序列如SEQIDNO.1的适配体V11为信号探针。3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，包括：(1)捕获探针偶联的免疫磁珠；(2)分析缓冲液；(3)信号探针偶联的酶结合物；(4)SA-HRP溶液；(5)...
【专利技术属性】
技术研发人员：茅凌翔，邹欣然，吴静，顾佳奇，贡佳怡，沈俐，
申请(专利权)人：镇江市第一人民医院，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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