磁性辅助的快速适配体选择方法技术

本发明专利技术提供一种磁性辅助的快速适配体选择方法。磁性辅助的快速适配体选择方法能够有效地产生具有高亲和力以及特异性的适配体。旋转磁场或交变磁场与标靶结合的磁性微米粒子或纳米粒子组合使用以选择对标靶具有期望的亲和力以及特异性的DNA适配体。

【技术实现步骤摘要】
磁性辅助的快速适配体选择方法
本专利技术涉及一种选择方法。具体地说，本专利技术涉及一种磁性辅助的快速适配体选择方法。
技术介绍
指数式浓缩的配体系统进化法(Systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment，简称SELEX)是一种用于从随机序列的大型组合库(原始库)分离DNA/RNA序列的体外选择方法，并且所分离的序列基于DNA/RNA折叠成与分子竞争的三维形状的能力结合于分子。成功的SELEX产品被称作‘适配体(aptamer)’，它的结构由结合袋组成，这些结合袋可以凭高特异性和亲和力结合于多种分子标靶，从微小分子(例如有机分子、离子、肽、蛋白质、核酸)、大分子到甚至整个细胞、病毒、寄生虫或组织。一旦针对分子标靶识别了适配体的序列，那么整个适配体可以通过化学合成来产生。此外，经官能团修饰的适配体可以增加其在各种生物应用中的稳定性，如对核酸是有害的环境。与传统的抗体产品相比较，适配体的一个优点在于不需要融合瘤和动物牺牲。适配体不仅具有成为一种出色的靶向病原性和恶性细胞或组织并且取代抗体的工具的潜能，而且还可以应用在纯化、诊断学、生物传感器以及抗感染剂上。然而，不同于抗体可以购得，对于进一步的应用适用的适配体较难以获得。SELEX包括多轮交替的培育、分离、洗脱、扩增以及纯化步骤，这些步骤可以概括为：(1)将原始DNA库与标靶分子混合；(2)将结合于标靶分子的DNA与未结合的DNA分离；(3)将结合的DNA从标靶分子洗脱；(4)洗脱的DNA通过PCR扩增以产生一种适配体浓缩的DNA库；以及(5)从所述PCR产物纯化出单链寡核苷酸。从在前一轮中获得的浓缩的序列库开始，重复此程序若干轮。通常，执行至少五轮到十五轮SELEX选择，直到不再可检测到功能性核酸物质浓缩为止。需要多轮的选择以分离出具有足够特异性和结合亲和力(例如纳摩尔解离常数，Kd)的适配体。一般说来，SELEX是一种耗时又冗长的方法。即使对于其中适配体的选择可以在数天内完成的自动化SELEX程序来说，它仍然需要大量制剂和高操作成本。另外，提出了若干功能性策略来简化此冗长的程序，包含毛细管电泳(CE-SELEX)和微流体SELEX(M-SELEX)。然而，CE-SELEX筛选结合小分子的适配体不太有效，而M-SELEX需要昂贵的微流体仪器。因为适配体在许多方面有潜力，所以希望发展一种有效的筛选方法，它足够简单地来快速筛选出适合应用的具有高亲和力和特异性的适配体。
技术实现思路
本专利技术提供一种磁性辅助的快速适配体选择方法，它利用生物功能化的磁性粒子从DNA库筛选能与标靶结合的寡核苷酸。所述磁性辅助的快速适配体选择(Magnetic-assistedrapidaptamerselection，简称MARAS)方法是一种有效获得高亲和力适配体的方法。此外，把其它适配体选择方法也需要的材料制备和事后分析排除在外，所述适配体选择方法可以在一小时内完成，并且可以自动化使之具高产能。本专利技术提供一种适配体选择方法。首先，提供样品，所述样品包括至少一个具有多个寡核苷酸序列的随机序列库以及上面接合有标靶分子的多个磁性纳米粒子或微米粒子。所述多个寡核苷酸序列的一部分结合于上面接合有标靶分子的多个磁性纳米粒子或微米粒子。通过施加振荡磁场到所述样品执行磁性辅助的筛选以分离结合于上面接合有标靶分子的多个磁性纳米粒子或微米粒子的所述多个寡核苷酸序列的部分。接着对所分离的结合于上面未接合标靶分子的多个磁性纳米粒子或微米粒子的所述多个寡核苷酸序列的部分执行阴性选择。接着通过使用磁性台架执行磁性分离以分离对标靶分子具有特异性的适配体。本专利技术还提供一种适配体选择方法。首先，提供样品，所述样品包括至少一个具有多个寡核苷酸序列的随机序列库以及上面接合有标靶分子的多个磁性纳米粒子或微米粒子。所述标靶分子通过附接到所述多个磁性纳米粒子或微米粒子的第一组分和附接到所述标靶分子的第二组分来接合到所述多个磁性纳米粒子或微米粒子。通过施加振荡磁场来执行磁性辅助的筛选以提供竞争机制。使用上面连接有第一组分的多个磁性纳米粒子或微米粒子，对样品执行阴性选择，以分离未结合于上面连接有第一组分的所述多个磁性纳米粒子或微米粒子的所述多个寡核苷酸的一部分。然后通过使用磁性台架执行磁性分离，以分离未结合于上面连接有第一组分的多个磁性纳米粒子或微米粒子的所述多个寡核苷酸序列的部分，从而选择对标靶分子具有特异性的适配体。根据本专利技术的实施例，所述振荡磁场是旋转磁场。根据本专利技术的实施例，执行磁性辅助的筛选的工艺进一步包括通过施加固定磁场强度和多种磁场频率的旋转磁场执行多轮磁性辅助的筛选，其中每轮磁性辅助的筛选中所用的磁场频率不同于其它轮磁性辅助的筛选的磁场频率。根据本专利技术的实施例，旋转磁场以14高斯施加，磁场频率在2赫兹到27千赫兹之间变化。根据本专利技术的实施例，所述振荡磁场是交变磁场。根据本专利技术的实施例，执行磁性辅助的筛选的工艺进一步包括通过施加固定磁场强度和多种磁场频率的交变磁场执行多轮磁性辅助的筛选，其中每轮磁性辅助的筛选中所用的磁场频率不同于其它轮磁性辅助的筛选的磁场频率。根据本专利技术的实施例，所述交变磁场以25高斯施加，磁场频率在2赫兹到200千赫兹之间变化。根据本专利技术的实施例，执行磁性辅助的筛选的工艺进一步包括通过施加固定磁场频率和多种磁场强度的交变磁场执行多轮磁性辅助的筛选，其中每轮磁性辅助的筛选中所用的磁场强度不同于其它轮磁性辅助的筛选的磁场强度。根据本专利技术的实施例，所述交变磁场以100千赫兹施加，磁场强度在12.5高斯到400高斯之间变化。根据本专利技术的实施例，所述标靶是C-反应蛋白，第一组分是链霉抗生物素蛋白(streptavidin)并且第二组分是生物素(biotin)。为了使本专利技术的以上提及和其它特征以及优点可理解，下文伴随附图详细描述若干例示性实施例。附图说明附图包含在内以提供对本专利技术的进一步了解，并且并入并构成本说明书的一部分。所述图说明本专利技术的实施例，并且连同说明一起，用以解释本专利技术的原理。图1A是根据本专利技术的一个实施例的旋转磁场磁性辅助的快速适配体选择(RO-MARAS)方法的实验装置的示意图；图1B是根据本专利技术的一个实施例的交变磁场磁性辅助的快速适配体选择(AC-MARAS)方法的实验装置的示意图；图2示意性说明根据本专利技术的一个实施例的RO-MARAS的频率相关性分析的工艺流程示意图；图3示出在RO-MARAS中所施加的磁场频率与通过根据本专利技术的一个实施例的RO-MARAS筛选的所选择的20N适配体的解离常数(Kd)的关系示意图；图4示出在AC-MARAS中所施加的磁场频率与通过根据本专利技术的一个实施例的AC-MARAS筛选的所选择的20N适配体的解离常数(Kd)的关系示意图；图5示出在AC-MARAS中所用的磁场强度与通过根据本专利技术的一个实施例的AC-MARAS筛选的所选择的20N适配体的解离常数(Kd)的关系示意图。具体实施方式本专利技术涉及一种适配体选择方法，它使用生物功能化的磁性粒子从DNA库筛选与标靶结合的寡核苷酸。因为C-反应蛋白(CRP)是发炎、心脏病发作、中风以及心血管疾病的一种常见指示物，所以CRP在以下实验中用作标靶并且用CRP涂布本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种适配体选择方法，其特征在于，包括：a)提供样品，所述样品包括至少一个具有多个寡核苷酸序列的随机序列库以及上面接合有标靶分子的多个磁性纳米粒子或微米粒子，其中所述多个寡核苷酸序列的第一部分结合于上面接合有所述标靶分子的所述多个磁性纳米粒子或微米粒子；b)通过使用磁性台架执行第一轮磁性分离以收集结合于上面接合有所述标靶分子的所述多个磁性纳米粒子或微米粒子的所述多个寡核苷酸序列的所述第一部分；c)使所述多个寡核苷酸序列的所述第一部分分散在缓冲液中；d)通过施加振荡磁场到结合于上面接合有所述标靶分子的所述多个磁性纳米粒子或微米粒子的所述多个寡核苷酸序列的所述第一部分，执行磁性辅助的筛选，以便所述多个寡核苷酸序列的所述第一部分的一部分与上面接合有所述标靶分子的所述多个磁性纳米粒子或微米粒子分开；e)通过使用所述磁性台架执行第二轮磁性分离以收集结合于上面接合有所述标靶分子的所述多个磁性纳米粒子或微米粒子的所述多个寡核苷酸序列的所述第一部分的第二部分，以便去除与上面接合有所述标靶分子的所述多个磁性纳米粒子或微米粒子分开的所述多个寡核苷酸序列的所述第一部分的所述部分；f)使结合于上面接合有所述标靶分子的所述多个磁性纳米粒子或微米粒子的所述多个寡核苷酸序列的所述第一部分的所述第二部分分散于所述缓冲液中；g)从上面接合有所述标靶分子的所述多个磁性纳米粒子或微米粒子洗脱所述多个寡核苷酸序列的所述第一部分的所述第二部分；h)通过使用所述磁性台架执行第三轮磁性分离以去除上面接合有所述标靶分子的所述多个磁性纳米粒子或微米粒子；以及i)对所述多个寡核苷酸序列的所述第一部分的所述第二部分执行阴性选择以选择对所述标靶分子具有特异性的适配体，其中对所述标靶分子具有特异性的所述适配体不结合于上面未接合所述标靶分子的所述多个磁性纳米粒子或微米粒子。...

【技术特征摘要】
2013.10.28 US 14/065,3821.一种适配体选择方法，其特征在于，包括：a)提供样品，所述样品包括至少一个具有多个寡核苷酸序列的随机序列库以及上面接合有标靶分子的多个磁性纳米粒子或微米粒子，其中所述多个寡核苷酸序列的第一部分结合于上面接合有所述标靶分子的所述多个磁性纳米粒子或微米粒子；b)通过使用磁性台架执行第一轮磁性分离以收集结合于上面接合有所述标靶分子的所述多个磁性纳米粒子或微米粒子的所述多个寡核苷酸序列的所述第一部分；c)使所述多个寡核苷酸序列的所述第一部分分散在缓冲液中；d)通过施加振荡磁场到结合于上面接合有所述标靶分子的所述多个磁性纳米粒子或微米粒子的所述多个寡核苷酸序列的所述第一部分，执行磁性辅助的筛选，以便所述多个寡核苷酸序列的所述第一部分的一部分与上面接合有所述标靶分子的所述多个磁性纳米粒子或微米粒子分开；e)通过使用所述磁性台架执行第二轮磁性分离以收集结合于上面接合有所述标靶分子的所述多个磁性纳米粒子或微米粒子的所述多个寡核苷酸序列的所述第一部分的第二部分，以便去除与上面接合有所述标靶分子的所述多个磁性纳米粒子或微米粒子分开的所述多个寡核苷酸序列的所述第一部分的所述部分；f)使结合于上面接合有所述标靶分子的所述多个磁性纳米粒子或微米粒子的所述多个寡核苷酸序列的所述第一部分的所述第二部分分散于所述缓冲液中；g)从上面接合有所述标靶分子的所述多个磁性纳米粒子或微米粒子洗脱所述多个寡核苷酸序列的所述第一部分的所述第二部分；h)通过使用所述磁性台架执行第三轮磁性分离以去除上面接合有所述标靶分子的所述多个磁性纳米粒子或微米粒子；以及i)对所述多个寡核苷酸序列的所述第一部分的所述第二部分执行阴性选择以选择对所述标靶分子具有特异性的适配体，其中对所述标靶分子具有特异性的所述适配体不结合于上面未接合所述标靶分子的所述多个磁性纳米粒子或微米粒子，所述标靶分子通过分别连接到所述多个磁性纳米粒子或微米粒子与所述标靶分子的结合对来接合到所述多个磁性纳米粒子或微米粒子，所述结合对包含连接到所述多个磁性纳米粒子或微米粒子的第一组分以及连接到所述标靶分子的第二组分，且步骤i)执行所述阴性选择包括：将上面连接有所述第一组分的多个磁性纳米粒子或微米粒子添加到所述多个寡核苷酸序列的所述第一部分的所述第二部分；将上面连接有所述第一组分的所述多个磁性纳米粒子或微米粒子与所述多个寡核苷酸序列的所述第一部分的所述第二部分一起培育；以及执行第四轮磁性分离以通过去除结合于上面连接有所述第一组分的所述多个磁性纳米粒子或微米粒子的所述多个寡核苷酸序列，获得对所述标靶分子具有特异性的所述适配体。2.根据权利要求1所述的适配体选择方法，其特征在于，所述振荡磁场是旋转磁场。3.根据权利要求2所述的适配体选择方法，其特征在于，所述旋转磁场的频率是从1赫兹到300千赫兹。4.根据权利要求2所述的适配体选择方法，其特征在于，所述旋转磁场的强度是从5高斯到1000高斯。5.根据权利要求1所述的适配体选择方法，其特征在于，所述振荡磁场是交变磁场。6.根据权利要求5所述的适配体选择方法，其特征在于，所述交变磁场的频率是从1赫兹到300千赫兹。7.根据权利要求5所述的适配体选择方法，其特征在于，所述交变磁场的强度是从5高斯到1000高斯。8.根据权利要求1所述的适配体选择方法，其特征在于，所述磁性纳米粒子的尺寸是从5纳米到500纳米。9.根据权利要求1所述的适配体选择方法，其特征在于，所述磁性微米粒子的尺寸是从0.50微米到50微米。10.一种适配体选择方法，其特征在于，包括：a)提供样品，所述样品包括至少一个具有多个寡核苷酸序列的随机序列库，并且用缓冲液稀释；b)通过与上面未接合标靶分子的多个第一磁性纳米粒子或微米粒子一起培育，对所述样品执行阴性选择，以分离未结合于上面未接合所述标靶分子的所述多个第一磁性纳米粒子或微米粒子的所述多个寡核苷酸序列的第一部分；c)执行第一轮磁性分离以从所述多个寡核苷酸序列的所述第一部分去除结合于上面未接合所述标靶分子的所述多个第一磁性纳米粒子或微米粒子的所述多个寡核苷酸序列；d)将所述多个寡核苷酸序列的所述第一部分与上面接合有标靶分子的多个第二磁性纳米粒子或微米粒子一起培育，其中所述多个寡核苷酸序列的所述第一部分的第二部分结合于上面接合有所述标靶分子的所述多个磁性纳米粒子或微米粒子；e)执行第二轮磁性分离以收集结合于上面接合有所述标靶分子的所述多个第二磁性纳米粒子或微米粒子的所述多个寡核苷酸序列的所述第一部分的所述第二部分；f)使结合于上面接合有所述标靶分子的所述多个第二磁性纳米粒子或微米粒子的所述多个寡核苷酸序列的所述第一部分的所述第二部分分散于所述缓冲液中；g)通过施加振荡磁场到结合于上面接合有所述标靶分子的所述多个第二磁性纳米粒子或微米粒子的所述多个寡核苷酸序列的所述第一部分的所述第二部分，执行磁性辅助的筛选，以便所述多个寡核苷酸序列的所述第一部分的所述第二部分的一部分与上面接合有所述标靶分子的所述多个第二磁性纳米粒子或微米粒子分开；h)通过使用磁性台架执行第三轮磁性分离以收集结合于上面接合有所述标靶分子的所述多个第二磁性纳米粒子或微米粒子的所述多个寡核苷酸序列的所述第一部分的所述第二部分的第三部分，以便去除与上面接合有所述标靶分子的所述多个第二磁性纳米粒子或微米粒子分开的所述多个寡核苷酸序列的所述第一部分的所述第二部分的所述部分；i)将结合于上面接合有所述标靶分子的所述多个第二磁性纳米粒子或微米粒子的所述多个寡核苷酸序列的所述第一部分的所述第二部分的所述第三部分用dd...

【专利技术属性】
技术研发人员：洪振义，赖吉庆，
申请(专利权)人：洪振义，
类型：发明
国别省市：中国台湾;71