本发明专利技术公开了特异性识别链霉素的单链DNA适配体及其应用，属于生物化学与分子生物学、分析化学和组合化学领域。本发明专利技术提供了利用改良的磁珠SELEX技术优选链霉素适配体的方法和得到的序列A1、A3、A6、A12四种与链霉素具有高亲和力的单链DNA适配体，为链霉素、特别是食品中链霉素残留的检测提供了稳定性良好、灵敏度高、成本低、易制备、易修饰和标记的高特异性检测识别元件。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及对链霉素特异性的新型识别元件-DNA适配体(Aptamer)的筛选及其应用，涉及生物化学与分子生物学、分析化学和组合化学领域。
技术介绍
氨基糖苷类抗生素，如链霉素、庆大霉素、新霉素、双氢链霉素等，对多种革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都具有显著的抗菌效果，可以有效抑制细菌的生长和繁殖，因此是目前我国农业、畜牧业和水产业中常用的兽药之一。但是该类抗生素的主要毒副作用体现为对于脑神经、听觉以及肾脏的损害，因此，针对该类药物在食品中的残留，许多国家和机构都规定了明确的最大残留限量(MRIJs)。由于养殖过程中经常存在着违法使用或者不合理使用的现象，食品中氨基糖苷类抗生素的过量残留，已经成为国内外普遍关注的食品安全问题之一。美国、加拿大等国官方机构调查发现链霉素是仅次于青霉素的最常在动物中残 留超标的药物。因此，加大对药物残留的监控力度，加强药残检测新技术的开发，特别是研究建立特异性强、灵敏度高、高效快速的链霉素残留的检测方法，对于食品安全控制及质量体系与国际标准接轨具有十分重要的意义。目前链霉素等氨基糖苷类抗生素的检测方法主要包括微生物法、仪器分析法和免疫分析方法等。微生物检测法是根据抗生素对特异微生物的抑制作用，来定性或定量检测受检样品中残留的抗生素的方法，该方法应用较为广泛，其优点是费用低，一般实验室都能操作，但测定时间长，结果误差较大，操作复杂，因此不能适应高通量高灵敏定量检测的需求。仪器检验方法是利用抗生素分子结构和理化性质来进行分离和定性定量测定，包括气相色谱法(GC)、液相色谱法(LC)、薄层色谱法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)、毛细管电泳法(CE)及各种联用技术等。此类方法灵敏度高，准确性好，但往往设备昂贵，对实验人员也有较高的要求，对样品的预处理要求较高，分析费时而不易推广。免疫分析法是利用抗原抗体特异性结合反应检测各种物质，在食品抗生素残留检测领域已较为广泛地应用。酶联免疫吸附测定(ELISA)将抗原和抗体的免疫反应和酶的高效催化反应有机结合，有效保证分析中的高选择性和高灵敏度，报道最多的是免疫分析方法。目前欧美已有一些公司生产针对抗生素残留检测的ELISA试剂盒产品，不过价格昂贵，酶标抗体的种类有限，只能检测少数种类常见的抗生素残留。由于链霉素是小分子化合物，本身不具有免疫原性，需将其与生物大分子如蛋白质连接后作为载体的抗原决定簇刺激动物才能产生特异性抗体，生产与应用存在较多的限制，包括抗原制备中免疫原性弱的抗生素半抗原难以产生高效价的抗体；产生于鼠、兔等动物的异源抗体在使用中有可能产生非特异性反应(假阳性)；抗体的制备成本高，费时费力，克隆株不易保存；批间质量不一；抗体的活性难以长时间保持，对温度敏感，易发生不可逆变性。这些都在很大程度上限制了免疫分析方法在链霉素检测中的应用。随着DNA结合蛋白研究的深入，受组合化学、抗体库和随机噬菌体肽库技术的启发，Tuerk和Gold构建了一种研究核酸结构、功能及进化的有效方法-指数富集配体系统进化技术(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment, SELEX)。该技术是建立随机寡核苷酸文库，并在体外筛选能与各种配体特异性结合的寡聚核苷酸片段的一项新组合化学技术，该技术对靶分子无特殊要求，可以是蛋白质、核酸、寡肽、小分子有机物甚至是金属离子，筛选出的寡核苷酸被称为适配体。利用SELEX技术筛选获得的适配体有着比抗体分子更高的特异性和亲和力，甚至能识别单抗不能区分的抗原物质。同时，与蛋白质性质的抗体相比，核酸适配体具有明显的优越性，例如不受免疫条件和免疫原性的限制，可在体外人工合成并且合成技术已非常成熟，变性与复性可逆，易于进行多种化学修饰，易于长期室温保存等。这些特性使得适配体在生物医药研究领域得到广泛应用。链霉素等氨基糖苷类抗生素，在生物体内的自然作用靶点正是通过结合细菌核糖体，抑制细菌蛋白质的合成，因此它们与核酸类分子存在天然的亲和性。近年来已有学者将适配体应用于抗生素的检测领域，同生物传感器平台结合，发展出快速、新颖的检测方法而备受关注。本专利技术筛选到可以与链霉素高亲和力结合的单链DNA (ssDNA)适配体序列，为链霉素尤其是食品中链霉素残留的检测提供了稳定性良好、灵敏度高、成本低、易制备、易修饰和标记的高特异性检测识别元件
技术实现思路
·本专利技术目的鉴于链霉素分子的结构特点，设计了改良的磁珠SELEX技术优选链霉素的方法，借助基于SELEX的组合化学技术，筛选得到能特异性结合链霉素的DNA适配体。该适配体是链霉素的新型识别元件，具有稳定性良好、灵敏度高、成本低、易制备、易修饰和标记的高特异性的优势。本专利技术的技术方案，提供了 I.特异性结合链霉素的单链DNA (ssDNA)适配体，选自序列表Af A16所示序列的一种或多种，包括含有Af A16所述序列的ssDNA。其中，序列表Af A16在结构上均符合下述通式 I 所示的结构特征，5’ -TAGGGAAITCGTCGACGGATCC-N35-CTGCAGGTCGACGCATGCGCCG-3’(通式I)其中N代表碱基A，T，C，G中任一个，N35代表随机片段长度为35个碱基。2.在序列表AfA16，优选序列A1、A3、A6或A12所示的序列，包括含有A1、A3、A6、A12所述序列的ssDNA。3.根据序列表AfA16所述的适配体，其被能提高稳定性的基团，提供检测信号的荧光基团、同位素、电化学标记物、酶标记物，以及用于形成组合物的亲和配基、巯基等所修饰。4.用于链霉素检测的组合物、试剂盒和芯片,其中含有序列表A1 A16中任一项的适配体。5.用于链霉素检测的方法，包括使可能含有链霉素的样品与序列表AfAie中任一项的适配体接触，并检测链霉素与所述适配体的结合。6.筛选特异性结合链霉素的ssDNA适配体的方法，包括步骤(a)_ (j) (a)筛选文库ssDNA文库；5 ’ -TAGGGAATTCGTCGACGGATCC-N35-CTGCAGGTCGACGCATGCGCCG-3 ’ 其中 N 代表碱基 A，T，C，G中任一个，N35代表随机片段长度为35个碱基。(b)亲和磁珠环氧基修饰磁珠，粒径浓度为10mg/ml ；(c)偶联有链霉素的未和磁珠(b)； Cd)使步骤(a)中的筛选文库和步骤(c)中的偶联链霉素的亲和磁珠在适宜的条件下保温、洗涤；所述适宜条件是指使筛选文库中的成员能和偶联链霉素的亲和磁珠特异性结合的条件，包括温度是室温25°C，作用时间30min，结合缓冲液成分为含有IOOmM NaCl、2mMMgCl2、5mM KClUmM CaCl2 和 0. 02% Tween 20 的 20mM Tris-HCl, pH7. 6 ； (e)收集经步骤(d)处理的与(c)中偶联链霉素亲和磁珠结合的文库成员； Cf)对步骤(e)的文库成员用上游引物跟生物素标记的下游引物进行PCR扩增处理；(g)将步骤(f)中的文库成员与链霉亲和素磁珠在适宜条件下接触，得到单链次级文库，将单链次级文库与步骤(C)中偶联链霉素的亲和磁珠在适宜条件下接触； 单链次级文库制备取链霉亲和素磁珠，用Bind a本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.特异性识别链霉素的单链DNA(ssDNA)适配体，选自序列表Α1 Α16所示序列的一种或多种，包括含有Al A16所述序列的ssDNA。2.根据权利要求I所述的适配体，选自序列Al、A3、A6或A12所示的序列，包括含有 Al、A3、A6、A12 所述序列的 ssDNA。3.根据权利要求I或2所述的适配体，其特征在于被能提高稳定性的基团，提供检测信号的荧光基团、同位素、电化学标记物、酶标记物，以及用于形成组合物的亲和配基、巯基所修饰。4.用于链霉素检测的组合物、试剂盒或芯片，其特征在于其中含有权利要求1-3中任一项的适配体。5.用于链霉素检测的方法，其特征在于使可能含有链霉素的样品与权利要求1-3中任一项的适配体接触，并检测链霉素与所述适配体的结合。6.筛选特异性结合链霉素的ssDNA适配体的方法，其特征在于包括步骤(a)- (j)(a)筛选文库ssDNA文库；(b)...
【专利技术属性】
技术研发人员：周楠迪，王靖元，田亚平，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：
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