本发明专利技术公开了一种基于离子通道和适配体制备生物传感器检测凝血酶的方法，属于生物传感器领域，所述的检测方法在离子通道上修饰DNA适配体，并采用P-ATP的混合溶液进行处理，最后进行喷金作为工作电极，得到基于离子通道和适配体的生物传感器对凝血酶进行检测。本发明专利技术的优点在于简单快速，灵敏度高，选择性好，可以进行实际样品中的检测，对凝血酶的最低检测浓度达到1pM，并且线性范围较大。在3nM-50nM浓度范围内，检测后的方波伏安峰电流和浓度的对数呈线性关系；峰电流值稳定，第10圈与第100圈峰值相差在3％以内；具有很强的专一性、重复性和实用性，在实际样品中的回收率在92％～105％范围。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物传感器领域，具体涉及一种。
技术介绍
凝血酶是一种多功能丝氨酸蛋白酶，在生物体内一系列生理和病理过程中起重要作用。它不但参与止血和凝血、炎症、免疫反应、组织修复和创伤愈合，而且可激活正常细胞的致瘤潜能和导致恶性细胞的转移表型。随着现代社会的发展，人们的物质生活水平不断提高，但随之而来的是各种疾病的侵袭。而这其中有很大一部分是心血管及脑部疾病，由于现在的检测技术有限，使很多可以治愈的疾病失去了最佳治疗期，从而造成不可挽回的后果。新近的研究表明，血凝块产生的凝血酶在这些过程中起着关键作用。从而为脑出血的治疗及研究提供了可能。参考文献ChunhaiFan, Kevin ff. Plaxco, and Alan J. Heeger. Electrochemical interrogation of conformational changes as a reagentless method for the sequence-specific detection of DNA. Applied Biological Sciences，2003， 100(16),9134-9137中记载，Plaxco K. W等人分别利用亚甲蓝标记的2个含碱基数不同的凝血酶适体构建了信号抑制型(信号抑制)和信号放大型(信号增益)的电化学传感器，将亚甲蓝标记的带32个碱基的凝血酶适体通过自组装作用固定在金电极表面。当未加入凝血酶时，适体呈随意的卷曲状态，亚甲蓝离电极的距离近，电子传递能力强，电流信号较大； 当加入凝血酶，适体折叠与凝血酶特异性结合形成G-四聚体椅状构象，亚甲蓝离电极表面的距离变远，电子传递能力减弱，电流信号显著降低，即为信号抑制型，检出限为6. 4nmol/ L。信号抑制型的优点是电极的表面可以更新，缺点是会检测到由于污染引起的假阳性结果。随后，他们又设计了信号增益型通过巯基自组装作用将27个碱基的适体固定在金电极表面，与另一条部分互补的标记亚甲蓝DNA链杂交(21个碱基)，杂交后，亚甲蓝距离电极表面较远，电子传递能力弱，亚甲蓝的还原电流很小；当加入凝血酶后，凝血酶与适体强烈的结合力使杂交双链部分解离，亚甲蓝离电极表面的距离变近，亚甲蓝的还原电流增大。该法测定的灵敏度为3nmol/L。信号增益型克服了信号抑制型可能会检测到的假阳性结果，提高了检测的灵敏度。而基于光信号、pH信号、离子信号等的离子通道，也是当今一大热门研究的方向。 参考文献 CorrelI B A,Breach L B, King L G，et al. · Nature，1997，387 :580-583 中记载，Correll等人在1997年研制出了一种新型的基于BLM的离子通道开关(ion_channel switch, ICS)生物传感器。该传感器在稳定性、灵敏度、选择性、可靠性等方面均有很大提高,通过改变受体的性质和类型,可用于血型分析,检测细菌、病毒、DNA、药物、抗体及电解质等，但是灵敏度和检测限都远远不能满足现有技术发展的需求
技术实现思路
本专利技术的目的是结合离子通道和传统的电极上的基于适配体生物传感器，使得适配体在电极上的修饰成为三维立体，脱离传统的二维平面的修饰。另外借助离子通道的开关概念，使得检测具有仿生和智能的性质。制备出机理为信号增益的检测凝血酶的生物传感器，达到信号放大的效果。本专利技术可以达到很低的检测限(IpM)和非常好的选择性，在实际样品中也有很好的应用。本专利技术提供的，具体步骤如下第一步离子通道的制备将刻蚀液9M NaOH溶液滴在PET膜一面上，在35摄氏度的温度下，进行刻蚀。通过控制时间的长短可控制离子通道孔径的大小。通常刻蚀30分钟，此时的孔径用电子显微镜测试后，约150nm 200nm。刻蚀完毕后，浸泡在IM HCOOH阻止溶液中30分钟。洗净放入去离子水中待用。第二步DNA适配体的配置与准备在PBS (phosphate buffer solution)缓冲溶液中加入DNA适配体，形成DNA适配体溶液，DNA适配体溶液放置在90摄氏度水浴下5分钟，然后自然冷却到常温。使用前放置在-20摄氏度条件下保存。第三步=P-ATP (对巯基苯胺)的配置以无水乙醇为溶剂，向溶剂中加入P-ATP， 得到含有IOmM的P-ATP的乙醇溶液，该乙醇溶液在使用前配置，密封保存，以免液体挥发。第四步在第一步制备的离子通道上修饰第二步中制备的DNA适配体将刻蚀好离子通道的PET膜放入DNA适配体溶液中，浸泡18小时以上。用去离子水冲洗表面，用滤纸吸干，再将其浸泡在第三步所配置的P-ATP的混合溶液中12小时。用去离子水冲洗表面， 也用滤纸吸干表面。第五步喷金作为工作电极在第四步处理好的PET膜的一面喷上纳米金，得到基于离子通道和适配体的生物传感器。所述的喷上纳米金的条件为电流为50mA，时间为8分钟，纳米金的厚度约为30nm。第六步应用第五步中的生物传感器进行检测(I)将制备好的喷金后的PET膜(即生物传感器)固定，并使PET膜上的离子通道与含有IOmM3+的缓冲溶液充分接触，38摄氏度常温孵化30分钟。(2)在含有3+的缓冲溶液中放入参比电极和对电极，用循环伏安法进行测量。(3)向缓冲溶液中加入待测量的凝血酶溶液，超声I分钟，放入38摄氏度的孵化箱 30分钟，再进行测量。(4)重复⑵ (3)，对不同浓度的凝血酶进行测量。循环伏安的扫描范围是O -O. 5V。本专利技术的优点在于简单快速，灵敏度高，选择性好，可以进行实际样品中的检测， 具体为(I)本专利技术提供的检测方法对于凝血酶的最低检测浓度可以达到ΙρΜ，并且线性范围较大。在3nM-50nM浓度范围内，检测后的方波伏安峰电流和浓度的对数呈线性关系；(2)检测速度快，峰电流值稳定，第10圈与第100圈峰值相差在3%以内；(3)本专利技术提供的检测方法具有很强的专一性，类似的凝血酶都不会对待测的凝血酶的检测产生干扰(如牛血红蛋白、溶菌酶和牛血清白蛋白)；(4)重复性好，数次检测结果的标准偏差不高于3% ；(5)本专利技术提供的检测方法具有良好的实用性，在实际样品中的回收率在92% 105%范围。附图说明图I :本专利技术中基于离子通道和适配体制备生物传感器检测凝血酶的机理图；图2 :本专利技术中的检测方法中所用模具的结构示意图；图3 :本专利技术中凝血酶浓度的电化学检测图(a)循环伏安图，检测电流峰高与浓度之间的关系图；(b)浓度与峰高值的关系图，插入的图为浓度3nM 50nM对数值与电流峰高值的线性关系图；图4 :本专利技术中检测的专一性(a)循环伏安图，(b)不同类似酶的相关信号百分数的柱状图。具体实施例方式下面将结合附图和实施例对本专利技术作进一步的详细说明。本专利技术提供的检测方法，是结合离子通道和适配体制备生物传感器检测凝血酶的方法。其具体原理如下如图I所示，本专利技术中在PET膜I上制备离子通道101，离子通道101的孔径为 150nm 200nm，在离子通道101的内壁修饰能与目标物4专一性结合的适配体2。所述的适配体 2 的 DNA 序列为 5 (NH2)-(CH2)6-CCA TCT CCA CTT GGT TGG TGT GGTTGG-3，。端基修饰氨基是为了和PET膜I上的羧基进本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李丽东，牟晓姣，陈郑博，林丽娟，
申请(专利权)人：北京航空航天大学，
类型：发明
国别省市：
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