【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，尤其涉及一种定量检测tp53基因拷贝数变异的方法和试剂盒。
技术介绍
1、肿瘤蛋白p53(tumor protein p53，tp53)基因位于人类染色体17p13.1，共有13个外显子，编码一种分子量为53kda的抑癌蛋白。tp53突变是急性髓系白血病(aml)的不良预后因素之一，且即使在经过强化治疗后，仍仅有12.8％的患者可以达到欧洲白血病网络指南所规定的aml不良预后分组患者的中位生存期。
2、拷贝数变异(copy number variations，cnv)，通常被定义为一个长度达到或超过1kb的dna片段在与一个参照基因组相比较时，存在拷贝数的变化。cnv包含缺失、插入、重复排列和复杂的多位点改变等。在tp53的cnv中，缺失型的变异常受到特别关注，因为其一条染色体上tp53基因的缺失，常导致细胞内野生型tp53基因的完全缺失，且这种变异在tp53突变患者中的发生率高达70.2％。有研究报道，tp53的拷贝数缺失与aml病人更短的总体生存期相关，尤其是对于那些同时携带有1个tp53突变位点的患者而言。
3、目前临床上有多种检测cnv的方法，包括旨在对于全基因组cnv进行检测的基于阵列的基因组杂交技术(acgh)、单核苷酸多态性阵列技术(snp array)、全外显子测序(wes)和全基因组测序技术等，以及旨在对于靶位点进行cnv评估的荧光实时定量pcr(qpcr)技术，多重连接探针扩增技术(mlpa)等。对于全基因组cnv进行检测常常价格不菲，且依赖于检测机构的算法，文库构
技术实现思路
1、为克服上述现有技术的不足，本专利技术提出一种定量检测tp53基因拷贝数变异的ddpcr方法和试剂盒。本专利技术提供的用于ddpcr技术检测tp53基因拷贝数变异的引物和探针是根据tp53和rpp30基因dna序列设计的，针对tp53基因第5和第7外显子基因序列分别设计了两条探针，针对rpp30基因第7外显子基因序列设计了一条探针，当tp53基因存在拷贝数变异时，通过ddpcr即可检测出其第5和/或第7外显子的拷贝数与rpp30基因拷贝数的比值发生了相应变化。
2、为达到上述目的，本专利技术提供以下技术方案：
3、本专利技术的第一方面提供了一种用于ddpcr定量检测tp53基因拷贝数变异的试剂盒，包含针对tp53和rpp30基因的特异性引物和探针，其中特异性引物的序列如下：
4、tp535号外显子正向引物：5’-tactcccctgccctcaa-3’(seq id no.1)
5、tp535号外显子反向引物：5’-ctgctcaccatcgctatct-3’(seq id no.2)
6、tp537号外显子正向引物：5’-aggttggctctgactgta-3’(seq id no.3)
7、tp537号外显子反向引物：5’-gtgatgatggtgaggatg-3’(seq id no.4)
8、rpp30正向引物：5’-tggcttttgaacttgtct-3’(seq id no.5)和
9、rpp30反向引物：5’-aaccatacctttcctttg-3’(seq id no.6)。
10、优选的，所述探针的序列如下：
11、tp535号外显子探针：5’-tggtgggggcagcgc-3’(seq id no.7)
12、tp537号外显子探针：5’-caactacatgtgtaac-3’(seq id no.8)和
13、rpp30探针：5’-accttctcattgtggagtctt-3’(seq id no.9)。
14、优选的，所述tp535号外显子探针的5’端标记荧光基团fam，3’端标记荧光淬灭基团bhq1；所述tp537号外显子探针的5’端标记荧光基团vic，3’端标记荧光淬灭基团mgb；所述rpp30探针的5’端标记荧光基团cy5，3’端标记荧光淬灭基团bhq3。
15、本专利技术的第二方面提供了一种定量检测tp53基因突变的ddpcr方法，包括如下步骤：
16、(1)提供待测样本，获得待测样本的dna；
17、(2)取上述待测样品dna作为模板，与上述试剂盒中的特异性引物和探针混合，配制ddpcr反应混合液；
18、(3)利用步骤(2)制备的ddpcr反应混合液与油相混合，通过微滴制备仪制备可独立进行pcr扩增反应的pcr微反应液滴，并导入芯片；
19、(4)对步骤(3)制备的芯片中的pcr微反应液滴进行pcr扩增反应；
20、(5)对经步骤(4)pcr扩增反应后芯片中的微滴进行信号收集，从而计算得出样本中tp53基因和rpp30基因的浓度；
21、(6)根据步骤(5)中所获得的tp53基因和rpp30基因的浓度，计算该二者的比值，从而得出样本中tp53基因的拷贝数变异情况。
22、优选的，所述步骤(1)中的待测样本为患者外周血、骨髓组织或者肿瘤组织。
23、优选的，fam标记的tp535号外显子探针或vic标记的tp537号外显子探针，与cy5标记的rpp30探针在同一pcr反应体系内，根据微滴分析仪自动分析的结果，读取样本中fam、vic及cy5通道的拷贝数浓度，并计算出样本基因组中tp535号和/或7号外显子的平均拷贝数，从而获得样本tp53基因拷贝数变异的情况。
24、优选的，样本基因组中tp535号外显子的平均拷贝数＝2*fam拷贝数/cy5拷贝数；tp537号外显子的平均拷贝数＝2*vic拷贝数/cy5拷贝数。
25、优选的，ddpcr反应混合液配制体系如下：
26、 10xdpcr反应缓冲液 3.5μl dpcr酶 1μl tp535号外显子正向引物 10pmol tp535号外显子反向引物 10pmol rpp30正向引物 10pmo本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于ddPCR定量检测TP53基因拷贝数变异的试剂盒，其特征在于，包含针对TP53和RPP30基因的特异性引物和探针，其中特异性引物的序列如下：
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述探针的序列如下：
3.一种定量检测TP53基因突变的ddPCR方法，其特征在于，包括如下步骤：
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的待测样本为患者外周血、骨髓组织或者肿瘤组织。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，ddPCR反应混合液配制体系如下：
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，ddPCR反应程序如下：
7.权利要求1-2任一项所述试剂盒在制备用于ddPCR定量检测TP53基因拷贝数变异的试剂中的应用。
【技术特征摘要】
1.一种用于ddpcr定量检测tp53基因拷贝数变异的试剂盒，其特征在于，包含针对tp53和rpp30基因的特异性引物和探针，其中特异性引物的序列如下：
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述探针的序列如下：
3.一种定量检测tp53基因突变的ddpcr方法，其特征在于，包括如下步骤：
4.根据权利要求3所述的方法...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵威，钱军，林江，姚冬明，袁倩，于迪，金晔，
申请(专利权)人：镇江市第一人民医院，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。