【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及植物分子生物学和植物育种领域，具体涉及水稻热精胺合成酶基因osacl5在调节水稻中胚轴伸长和直播出苗率中的应用。
技术介绍
1、水稻是我国最重要的粮食作物之一，我国60％以上的人口以稻米为主食。然而，我国目前也面临着人口老龄化、农业劳动力缺乏的问题。通过直播水稻可以节省大量的人力，解决劳动力短缺的问题。但是当前的直播水稻却存在着发芽差、难以全苗、出苗不整齐等问题，所以提高直播水稻的发芽出苗率俨然成为了迫在眉睫的难题。
2、水稻的胚轴主要分为下胚轴、中胚轴和上胚轴这三个部分，其中中胚轴对于种子破土出苗至关重要，中胚轴是指胚芽鞘节与胚根着生点之间的部分。通常，中胚轴长的品种，在深覆土条件下，具有萌发速率高、出苗速度快等优点。然而，目前水稻中克隆的中胚轴伸长相关基因非常少，相关的分子机制也不清楚。因此，通过克隆中胚轴伸长相关基因，创制优良等位变异，有助于选育水稻中胚轴长和直播出苗率提高的品种。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供水稻热精胺合成酶基因osacl5在调控水稻中胚轴伸长进而影响直播出苗率中的应用。通过构建osacl5基因的敲除植株，发现该基因可以调控水稻中胚轴长度和种子直播出苗率，这为培育适宜直播的水稻新品种提供了新的基因资源，对耐直播水稻品种的选育具有重要意义。
2、为实现上述目的，本专利技术提供了如下方案：
3、本专利技术提供水稻热精胺合成酶基因osacl5在调控水稻中胚轴伸长和直播出苗率中的应用。
4、优
5、本专利技术提供了一种在水稻中敲除osacl5基因的方法。
6、靶向敲除水稻热精胺合成酶基因osacl5的方法，采用crispr/cas9基因编辑技术，选取osacl5基因的靶点序列以及相应的上游引物和下游引物，先后构建中间载体和最终载体；将最终载体侵染水稻愈伤组织，获得水稻osacl5基因的敲除转基因水稻植株，即完成水稻osacl5基因的靶向敲除。
7、优选的，所述的靶点序列为osacl5基因的第四外显子上的一段长度为20bp的片段，靶点序列为5’-tccacagggtcgtcatgtgc-3’(seq id no.3)。
8、优选的，所述上游引物的核苷酸序列为ggcatccacagggtcgtcatgtgc(seq idno.4)，所述下游引物的核苷酸序列为aaacgcacatgacgaccctgtgga(seq id no.5)。
9、优选的，所述中间载体的构建方法包括以下步骤：1.利用限制性内切酶aari对中间载体sk-grna进行酶切；2.将上下游引物等比例混合后，100℃变性5分钟,室温冷却后形成带有粘性末端的片段；3.通过t4连接酶，将酶切后的sk-grna载体和带有粘性末端的片段进行连接，转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，得到含有目标片段的中间载体sk-grna-osacl5。
10、优选的，所述最终载体的构建方法包括以下步骤：1.利用限制性内切酶kpni和bamhi对最终载体pc1300-cas9进行酶切，形成带有粘性末端的载体；2.将上述步骤获得的中间载体sk-grna-osacl5用限制性内切酶kpni和bglii进行酶切，并回收片段；3.将带有粘性末端的pc1300-cas9载体和上述片段进行连接，转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，通过测序检测获得含有靶点序列的最终载体pc1300-cas9-grna-osacl5。
11、将构建成功的最终载体转化农杆菌eha105感受态细胞，侵染水稻愈伤组织，通过潮霉素筛选获得转基因水稻植株。
12、优选的，通过osacl5测序特异性引物acl5-f：catcacgcacccacgcata(seq idno.6)和acl5-r：cctcctattctagtcaaacactaatcc(seq id no.7)对上述转基因水稻植株进行测序筛选，最终获得了插入1个碱基“a”的突变体株系osacl5-1和缺失5个碱基“acagg”的突变体株系osacl5-2(图1)。
13、本专利技术还提供一种调控水稻中胚轴长度的方法，所述方法包括在水稻中敲除水稻热精胺合成酶基因osacl5，所述水稻热精胺合成酶基因osacl5的核苷酸序列如seq idno.1所示。
14、进一步的，采用crispr/cas9基因编辑技术，获得水稻osacl5基因的敲除转基因水稻植株。
15、有益效果
16、本专利技术的osacl5基因及其编码蛋白可用于调控水稻中胚轴伸长，进而影响水稻直播出苗率。敲除osacl5会显著增加水稻中胚轴长度(图2)，提高水稻出苗率(图3、4)。与野生型相比，osacl5-1敲除突变体中胚轴长度增加了168.8％，osacl5-2增加了235.4％，均达到极显著差异(图2)。播种9天后，osacl5-1的出苗率相较于野生型增加了20.8％，osacl5-2的出苗率相较于野生型增加了24.8％(图4)。因此，本专利技术可以用于解决水稻直播过程中出苗差及出苗不整齐等问题，具有广阔的应用前景。
17、本专利技术利用crispr/cas9基因编辑技术，获得了具有中胚轴长和直播出苗率高的osacl5基因敲除突变体植株。该方法可用于选育中胚轴长和直播出苗率高的水稻种质，避免了传统杂交选育的工作，大大缩短了水稻品种选育的周期。
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1.水稻热精胺合成酶基因OsACL5在调节中胚轴伸长中的应用，其特征在于，所述水稻热精胺合成酶基因OsACL5的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.水稻热精胺合成酶基因OsACL5在调节直播出苗率中的应用，其特征在于，所述水稻热精胺合成酶基因OsACL5的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.一种提高水稻直播出苗率的方法，其特征在于，所述方法包括在水稻中敲除水稻热精胺合成酶基因OsACL5，所述水稻热精胺合成酶基因OsACL5的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法包括：采用CRISP R/Cas9基因编辑技术，获得水稻OsACL5基因的敲除转基因水稻植株。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，靶点序列如SEQ ID NO.3所示。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，引物序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，将构建成功的最终载体转化农杆菌EHA105感受态细胞，
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，通过OsACL5测序特异性引物对上述转基因水稻植株进行测序筛选，所述OsACL5测序特异性引物的序列为：
9.一种调控水稻中胚轴长度的方法，其特征在于，所述方法包括在水稻中敲除水稻热精胺合成酶基因OsACL5，所述水稻热精胺合成酶基因OsACL5的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述方法包括：采用CRISPR/Cas9基因编辑技术，获得水稻OsACL5基因的敲除转基因水稻植株。
...【技术特征摘要】
1.水稻热精胺合成酶基因osacl5在调节中胚轴伸长中的应用，其特征在于，所述水稻热精胺合成酶基因osacl5的核苷酸序列如seq id no.1所示。
2.水稻热精胺合成酶基因osacl5在调节直播出苗率中的应用，其特征在于，所述水稻热精胺合成酶基因osacl5的核苷酸序列如seq id no.1所示。
3.一种提高水稻直播出苗率的方法，其特征在于，所述方法包括在水稻中敲除水稻热精胺合成酶基因osacl5，所述水稻热精胺合成酶基因osacl5的核苷酸序列如seq id no.1所示。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法包括：采用crisp r/cas9基因编辑技术，获得水稻osacl5基因的敲除转基因水稻植株。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，靶点序列如seq id no.3所示。
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【专利技术属性】
技术研发人员：周勇，包诗钰，李先锋，缪军，梁国华，李相伯，龚志云，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：
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