本发明专利技术提供了用于从复杂基质制备标记的葡基胺的方法。所述方法包括以下步骤：使复杂基质中的糖蛋白变性而形成变性的复杂基质混合物；将所述变性的复杂基质混合物加载到MWCO过滤装置上；将糖苷酶酶溶液添加到所述MWCO过滤装置上而形成包含葡基胺的去糖基化的复杂基质混合物；收集从所述MWCO过滤装置释放的葡基胺；以及用快速标记试剂使葡基胺衍生化而形成适用于在各种液相色谱系统和检测器中检测的多种标记的葡基胺。
Rapid preparation of labelled glucoamylamine from complex substrates by molecular weight interception filtration and glycosylation on filters
The present invention provides a method for preparing labeled meglumine from a complex matrix. The method comprises the following steps: denaturing glycoproteins in complex matrices to form denatured complex matrix mixtures; loading the denatured complex matrix mixtures onto the MWCO filter device; adding the glycosidase solution to the MWCO filter device to form a complex matrix mixtures containing deglycosylation of glucoamylase; and collecting the glucoamyl released from the MWCO filter device. Amine; and the derivatization of meglumine with rapid labeling reagents to form a variety of labelled meglumine suitable for detection in various liquid chromatography systems and detectors.
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用分子量截留过滤和过滤器上去糖基化从复杂基质快速制备标记的葡基胺的方法相关申请的交叉引用本申请要求2016年7月1日提交的美国临时专利申请No.62/357,552的优先权，该申请以引用方式并入本文。
技术介绍
用于分析复杂基质中存在的糖蛋白的方法包括以下步骤：去糖基化，之后用标记试剂衍生化而产生衍生化的葡基胺。在某些条件下，可在不从生物样品分离糖蛋白的情况下进行衍生化。在给定情况下，复杂基质中衍生化的葡基胺的分析可一直持续到包括高效液相色谱(“HPLC”)、超高效液相色谱(UHPLC)、质谱(“MS”)、超临界流体色谱、紫外(“UV”)、荧光(“FLR”)检测、基质辅助激光解吸/电离质谱(“MALDI-MS”)和/或毛细管电泳(“CE”)的分析和/或检测。此外，最近已开发了允许葡基胺的快速衍生化而不会引起生物样品的降解或过度标记的方法。已描述了一种此类程序，其中样品在不预先纯化的情况下被去糖基化，并且用快速标记试剂RapiFluor-MS(“RFMS”)进行标记。参见作为WO2016/069764公布的国际申请No.PCT/US2015/057848。然而，并非所有样品类型都适于该简约方法，因为它们可能含有能够干扰葡基胺衍生化反应的亲核分子。在此类情况下，糖蛋白通常需要使用洗涤剂和其他试剂来有效增溶。必须在质谱检测之前去除这些洗涤剂和试剂，因为它们的存在可不利于该分析。此外，可能需要大量细胞，这阻止了中至高通量分析并且通常排除了重复样的制备，从而无法报告固有样品间变异性之间的差别以及不同生物样品之间的差异。Rahman,S.A,etal.,Filter-AidedN-GlycanSeparation(FANGS):AConvenientSamplePreparationMethodforMassSpectrometricN-GlycanProfiling,J.ProteomeRes.2014,13,1167-1176(2014)at1167-68(Rahman,S.A等人，“过滤器辅助N-聚糖分离(FANGS)：一种用于质谱N-聚糖谱分析的方便样品制备方法”，《蛋白质组研究杂志》，2014年，第13卷，第1167-1176页中的第1167-1168页)。因此，已开发了克服这些问题的方法，这些方法可包括使用甲基酯化的唾液酸、昂贵试剂(诸如siRNA)和/或分离的膜–这些都不是适合中至高通量分析的溶液。同上第68页。此外，这些方法的葡基胺分离和纯化步骤可较复杂，特别是对于质谱分析而言。同上此外，已设计了将糖蛋白固定到膜上的方法。然而，这些膜由疏水性聚合物(诸如PVDF、尼龙和硝化纤维)构造而成，并且在结合能力方面有限，因为此类膜依赖于基于吸附的保留。参见例如Baginski等人的US8,198,063B1。例如，在越来越高的质量负载下，疏水性膜将变饱和。另外，非分析物疏水性化合物将污浊疏水性膜，达到超过糖蛋白对膜的吸附的程度。因此需要可建立对复杂基质中的葡基胺的中至高通量分析的方法。
技术实现思路
提供了用于从复杂基质制备标记的葡基胺的方法。本专利技术方法包括以下步骤：(a)使复杂基质中的糖蛋白变性而形成变性的复杂基质混合物；(b)将变性的复杂基质混合物加载到分子量截留(“MWCO”)过滤装置上；(c)将糖苷酶酶溶液添加到MWCO过滤装置上，其中MWCO过滤装置上的糖蛋白被去糖基化，并且形成包含葡基胺的去糖基化的复杂基质混合物；(d)收集从MWCO过滤装置释放的葡基胺；以及(e)用快速标记试剂使葡基胺衍生化而形成多种标记的葡基胺。在一个实施方案中，该方法还可包括稀释变性的复杂基质混合物的步骤。在一个实施方案中，该方法还可包括离心变性的复杂基质混合物的步骤。此外，在一个实施方案中，该方法还可包括稀释去糖基化的复杂基质混合物的步骤。在一个实施方案中，加热和/或温育MWCO过滤装置。在一个实施方案中，MWCO过滤装置是96孔滤板。在一个实施方案中，葡基胺穿过MWCO过滤装置流动到滤液收集装置。在一个实施方案中，在液相色谱系统中检测所述多种标记的葡基胺。另外，本文提供了用于制备葡基胺的试剂盒，该试剂盒包括MWCO过滤装置、快速标记试剂、变性溶液和酶溶液。变性溶液使复杂基质中的糖蛋白变性而形成变性的复杂基质混合物。将酶溶液与过滤装置上变性的复杂基质一起混合和温育而得到葡基胺。用MWCO过滤装置对去糖基化的复杂基质混合物进行过滤而得到葡基胺。用快速标记试剂使葡基胺衍生化。能够在液相色谱系统、毛细管电泳和/或MALDI-MS系统中检测标记的葡基胺。本文还提供了具有MWCO过滤装置、荧光检测装置和质谱检测装置的液相色谱系统。在液相色谱系统中，MWCO过滤装置被构造为产生葡基胺，这些葡基胺被收集用于衍生化以及后续在荧光检测装置中的荧光检测和在质谱检测装置中的质谱检测。附图说明图1是使用过滤器上去糖基化从复杂基质制备标记的葡基胺的方法步骤的示意图。图2A和图2B示出了如亲水作用色谱和荧光检测所分析的标记的葡基胺样品的比较。图2A示出了在存在过滤器上去糖基化的情况下执行样品制备而得出的清晰、可判读的聚糖信号。图2B示出了在不存在过滤器上去糖基化的情况下执行样品制备而得出的受影响的聚糖信号。具体实施方式本文描述了用于从复杂基质制备标记的葡基胺的新型方法，一般称为“过滤器上去糖基化”。葡基胺或N-糖苷是由具有β-N-糖苷键的胺组成的一类化合物，该β-N-糖苷键键合至碳水化合物而形成环状半胺醛醚键(α-氨基醚)。葡基胺具有连接到氨基的糖基。葡基胺可包括但不限于核苷(诸如腺苷)以及具有胺基的糖苷，诸如N,N-二甲基-β-d-吡喃葡萄糖胺、葡基胺、葡糖基-正丁胺、葡糖基-正己胺、葡糖基-正辛胺、葡糖基-正癸胺、葡糖基-正十二胺、麦芽糖基-正十二胺。在存在一当量碳酸氢铵的情况下用氨水溶液处理后，D-葡萄糖、D-半乳糖、乳糖、纤维二糖和麦芽糖都会产生对应葡基胺，即1-氨基-1-脱氧-D-葡萄糖、1-氨基-1-脱氧-D-半乳糖、1-氨基-1-脱氧乳糖、1-氨基-1-脱氧纤维二糖和1-氨基-1-脱氧麦芽糖。我们已发现，并非所有复杂基质(本文也称为“糖蛋白样品”或“样品”)都适于此前所述的制备技术。参见例如Lauber,M.A.etal,RapidPreparationofReleasedN-GlycansforHILICAnalysisUsingaLabelingReagentthatFacilitatesSensitiveFluorescenceandESI-MSDetection.AnalChem,87(10),5401-9(2015)(Lauber,M.A.等人，“使用促进灵敏荧光和ESI-MS检测的标记试剂快速制备释放的N-聚糖以供HILIC分析”，《分析化学》，第87卷，第10期，第5401-5409页，2015年)。复杂基质中含有某些糖蛋白分析物，除了别的以外，这些复杂基质还可包含能够干扰葡基胺衍生化反应的亲核分子。因此，本文提供了用于从复杂基质制备标记的葡基胺的方法。在本专利技术方法中，糖蛋白样品在分子量截留(“MWCO”)过滤装置上被去糖基化，以最大程度减少样品处理步骤的数量和样品制备时间。在去糖基化反应之后，使葡基胺滤过MWC本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于从复杂基质制备标记的葡基胺的方法，包括以下步骤：使复杂基质中的糖蛋白变性而形成变性的复杂基质混合物；将所述变性的复杂基质混合物加载到MWCO过滤装置上；将糖苷酶酶溶液添加到所述MWCO过滤装置上，其中所述MWCO过滤装置上的所述糖蛋白被去糖基化，并且形成包含葡基胺的去糖基化的复杂基质混合物；收集从所述MWCO过滤装置释放的葡基胺；以及用快速标记试剂使葡基胺衍生化而形成多种标记的葡基胺。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.07.01 US 62/3575521.一种用于从复杂基质制备标记的葡基胺的方法，包括以下步骤：使复杂基质中的糖蛋白变性而形成变性的复杂基质混合物；将所述变性的复杂基质混合物加载到MWCO过滤装置上；将糖苷酶酶溶液添加到所述MWCO过滤装置上，其中所述MWCO过滤装置上的所述糖蛋白被去糖基化，并且形成包含葡基胺的去糖基化的复杂基质混合物；收集从所述MWCO过滤装置释放的葡基胺；以及用快速标记试剂使葡基胺衍生化而形成多种标记的葡基胺。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述MWCO过滤装置被加热。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述MWCO过滤装置被温育。4.根据权利要求1所述的方法，其中所述变性的复杂基质混合物通过液体处理系统加载到所述MWCO过滤装置上。5.根据权利要求1所述的方法，还包括稀释所述变性的复杂基质混合物的步骤。6.根据权利要求1所述的方法，还包括离心所述变性的复杂基质混合物的步骤。7.根据权利要求1所述的方法，还包括稀释所述去糖基化的复杂基质混合物的步骤。8.根据权利要求1所述的方法，其中所述葡基胺穿过所述MWCO过滤装置流动到滤液...
【专利技术属性】
技术研发人员：MA劳伯，
申请(专利权)人：沃特世科技公司，
类型：发明
国别省市：美国,US
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