一种二氢硫辛酸琥珀酰转移酶抑制剂的筛选方法技术

本发明专利技术涉及一种二氢硫辛酸琥珀酰转移酶抑制剂的筛选方法。包括在离体及活体条件下对二氢硫辛酸琥珀酰转移酶抑制剂的筛选。首先通过待筛选抑制剂预处理总蛋白或重组二氢硫辛酸琥珀酰转移酶或者活细胞，然后用能标记二氢硫辛酸琥珀酰转移酶的探针处理反应体系，经点击化学反应偶联Biotin‑N3后再通过streptavidin blot法进行成像分析。本方法的建立对二氢硫辛酸琥珀酰转移酶抑制剂的筛选具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】
一种二氢硫辛酸琥珀酰转移酶抑制剂的筛选方法
本专利技术涉及的是生物化学领域，涉及一种二氢硫辛酸琥珀酰转移酶抑制剂的筛选方法，具体地说，涉及一种二氢硫辛酸琥珀酰转移酶抑制剂的离体及活体筛选方法。
技术介绍
二氢硫辛酸琥珀酰转移酶(DLST)作为α-酮戊二酸脱氢酶复合体(α-ketoglutaratedehydrogenasecomplex)的核心组成部分，在催化α-酮戊二酸转换成琥珀酰辅酶A过程中发挥着关键作用，是三羧酸循环(TCA)的重要组成部分[1-3]。研究表明DLST蛋白与多种疾病的发生密切相关，如阿尔茨海默病[4-6]、白血病[7]、心血管疾病[8]等，因此DLST蛋白是一种重要的疾病治疗靶标，DLST抑制剂成为疾病治疗相关的潜在药物。当前，高效、高选择性的DLST抑制剂几乎没有，因而导致对DLST的功能研究面临极大的挑战。近年来，CPI613作为一种α-酮戊二酸脱氢酶复合体抑制剂，目前已被用于治疗白血病和非小细胞肺癌的临床实验[9-10]。CPI613是一种硫辛酸类似物，通过与硫辛酸竞争性结合DLST从而抑制DLST活性，但同时CPI613也能抑制丙酮酸脱氢酶复合体的活性，其选择性欠缺，因而亟需开发高效、专一的DLST抑制剂。然而由于缺乏有效的DLST抑制剂筛选平台，目前对DLST抑制剂的研发仍然十分艰难，因此构建一种高效的DLST抑制剂筛选方法对于DLST抑制剂的开发及其功能研究具有十分重要的意义。本申请所引用
技术介绍
文献如下所示：[1]Yang,L.；Shi,Q.；Ho,D.J.；Starkov,A.A.；Wille,E.J.；Xu,H.；Chen,H.L.；Zhang,S.；Stack,C.M.；Calingasan,N.Y.；Gibson,G.E.；Beal,M.F.Micedeficientindihydrolipoylsuccinyltransferaseshowincreasedvulnerabilitytomitochondrialtoxins.Neurobiol.Dis.,2009,36,320-330.[2]Starkov,A.A.Anupdateontheroleofmitochondrialα-ketoglutaratedehydrogenaseinoxidativestress.Mol.Cell.Neurosci.,2013,55,13-16.[3]Guo,H.；Madzak,C.；Du,G.；Zhou,J.Mutagenesisofconservedactivesiteresiduesofdihydrolipoamidesuccinyltransferaseenhancestheaccumulationofα-ketoglutarateinYarrowialipolytica.Appl.Microbiol.Biotechnol.,2016,100,649-659.[4]Gibson,G.E.；Blass,J.P.；Beal,M.F.；Bunik,V.Theα-ketoglutarate-dehydrogenasecomplex.Mol.Neurobiol.,2005,31,43-63.[5]Dumont,M.；Ho,D.J.；Calingasan,N.Y.；Xu,H.；Gibson,G.；Beal,M.F.Mitochondrialdihydrolipoylsuccinyltransferasedeficiencyacceleratesamyloidpathologyandmemorydeficitinatransgenicmousemodelofamyloiddeposition.FreeRadic.Biol.Med.,2009,47,1019-1027.[6]Gibson,G.E.；Starkov,A.；Blass,J.P.；Ratan,R.R.；Beal,M.F.Causeandconsequence:mitochondrialdysfunctioninitiatesandpropagatesneuronaldysfunction,neuronaldeathandbehavioralabnormalitiesinage-associatedneurodegenerativediseases.Biochim.Biophys.Acta,2010,1802,122-134.[7]Anderson,N.M.；Li,D.；Peng,H.L.；Laroche,F.J.F.；Mansour,M.R.；Gjini,E.；Aioub,M.；Helman,D.J.；Roderick,J.E.；Cheng,T.；Harrold,I.；Samaha,Y.；Meng,L.；Amsterdam,A.；Neuberg,D.S.；Denton,T.T.；Sanda,T.；Kelliher,M.A.；Singh,A.；Look,A.T.；Feng,H.TheTCAcycletransferaseDLSTisimportantforMYC-mediatedleukemogenesis.Leukemia,2016,30,1365-1374.[8]Heggermont,W.A.；Papageorgiou,A.P.；Quaegebeur,A.；Deckx,S.；Carai,P.；Verhesen,W.；Eelen,G.；Schoors,S.；vanLeeuwen,R.；Alekseev,S.；Elzenaar,I.；Vinckier,S.；Pokreisz,P.；Walravens,A.S.；Gijsbers,R.；Haute,C.V.D.；Nickel,A.；Schroen,B.；vanBilsen,M.；Janssens,S.；Maack,C.；Pinto,Y.；Carmeliet,P.；Heymans,S.InhibitionofMicroRNA-146aandOverexpressionofItsTargetDihydrolipoylSuccinyltransferaseProtectAgainstPressureOverload-InducedCardiacHypertrophyandDysfunction.Circulation,2017,136,747–761.[9]Lycan,T.W.；Pardee,T.S.；Petty,W.J.；Bonomi,M.；Alistar,A.；Lamar,Z.S.；Isom,S.；Chan,M.D.；Miller,A.A.；Ruiz,J.AphaseIIclinicaltrialofCPI-613inpatientswithrelapsedorrefractorysmallcelllungcarcinoma.PLoSONE,2016,11:e0164244.[10]Pardee,T.S.；Lee,K.；Luddy,J.；Maturo,C.；Rodriguez,R.；Isom,S.；Miller,L.D.；Stadelman,K.M.；Levitan,D.；Hurd,D.；Ellis,L.R.；Harrelson,R.；Manuel,M.；D本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种二氢硫辛酸琥珀酰转移酶抑制剂的筛选方法，其特征在于包括：用抑制剂预处理离体或活体介质得到预处理反应体系的步骤，所述离体或活体介质选自细胞裂解物、二氢硫辛酸琥珀酰转移酶或病菌；优选选自水稻白叶枯病菌细胞裂解物、柑橘溃疡病菌细胞裂解物、重组水稻白叶枯病菌二氢硫辛酸琥珀酰转移酶、水稻白叶枯病菌、柑橘溃疡病菌。

【技术特征摘要】
1.一种二氢硫辛酸琥珀酰转移酶抑制剂的筛选方法，其特征在于包括：用抑制剂预处理离体或活体介质得到预处理反应体系的步骤，所述离体或活体介质选自细胞裂解物、二氢硫辛酸琥珀酰转移酶或病菌；优选选自水稻白叶枯病菌细胞裂解物、柑橘溃疡病菌细胞裂解物、重组水稻白叶枯病菌二氢硫辛酸琥珀酰转移酶、水稻白叶枯病菌、柑橘溃疡病菌。2.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于还包括：使用探针处理所述预处理反应体系。3.根据权利权利要求1所述的筛选方法，其特征在于：所述抑制剂为4.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于：所述探针为下述式I化合物所示：其中R1选自任意取代的亚烷基、亚氨基、任意取代的亚烯基、任意取代的亚炔基、任意取代的亚环烷基、任意取代的亚芳基或任意取代的亚杂芳基；优选地，选自任意取代的C1-6亚烷基、任意取代的C1-6亚芳基；更优选地，选自亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚异丙基、亚丁基、亚仲丁基、亚戊基、亚邻苯基、亚间苯基、亚对苯基、亚邻噻吩基、亚间噻吩基、亚邻呋喃基、亚间呋喃基、亚邻吡啶基、亚间吡啶基、亚对吡啶基、亚萘基、亚蒽基、亚卤代苯基；最优选地，选自R2选自氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基、杂芳基；优选地，选自C1-6烷基或C1-6芳基；更优选地，选自甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、仲丁基、戊基或苯基。最优选地，所述探针化合物选自下述化合物：探针1：2-(甲磺酰基)-5-(4-氟-3-(丙炔基氧基)甲基)苯基-1,3,4-噁二唑；探针2：2-(乙磺酰基)-5-(4-氟-3-(丙炔基氧基)甲基)苯基-1,3,4-噁二唑；探针3：2-(甲磺酰基)-5-(3-(丙炔基氧基)甲基)苯基-1,3,4-噁二唑；探针4：2-(乙磺酰基)-5-(3-(丙炔基氧基)甲基)苯基-1,3,4-噁二唑；探针5：2-(甲磺酰基)-5-(2,4-二氯-3-(丙炔基氧基)甲基)苯基-1,3,4-噁二唑；探针6：2-(乙磺酰基)-5-(2,4-二氯-3-(丙炔基氧基)甲基)苯基-1,3,4-噁二唑。5.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于还包括：经探针处理后的体系在Biotin-N3存在下进行点击化学反应。6.根据权利要求5所述的筛选方法，其特征在于还包括：进行成像反应分析的步骤。7.根据根据权利要求5所述的筛选方法，其特征在于包括：用抑制剂预处理离体或活体介质得到预处理反应体系；优选地，所述离体或活体介质选自细胞裂解物、二氢硫辛酸琥珀酰转移酶或病菌；优选地选自水稻白叶枯病菌细胞裂解物、柑橘溃疡病菌细胞裂解物、重组水稻白叶枯病菌二氢硫辛酸琥珀酰转移酶、水稻白叶枯病菌、柑橘溃疡病菌；然后使用探针处理所述预处理反应体系；所述抑制剂为所述探针为下述式I化合物所示：其中R1选自任意取代的亚烷基、亚氨基、任意取代的亚烯基、任意取代的亚炔基、任意取代的亚环烷基、任意取代的亚芳基或任意取代的亚杂芳基；优选地，选自任意取代的C1-6亚烷基、任意取代的C1-6亚芳基；更优选地，选自亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚异丙基、亚丁基、亚仲丁基、亚戊基、亚邻苯基、亚间苯基、亚对苯基、亚邻噻吩基、亚间噻吩基、亚邻呋喃基、亚间呋喃基、亚邻吡啶基、亚间吡啶基、亚对吡啶基、亚萘基、亚蒽基、亚卤代苯基；最优选地，选自R2选自氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基、杂芳基；优选地，选自C1-6烷基或C1-6芳...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨松，陈彪，龙青素，赵永亮，吴元元，薛伟，
申请(专利权)人：贵州大学，
类型：发明
国别省市：贵州,52