稳定的液体纤维蛋白原制造技术

本发明专利技术涉及液体形式的包含稳定的纤维蛋白原的组合物。

Stable liquid fibrinogen

The present invention relates to a liquid composition containing stable fibrinogen.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】稳定的液体纤维蛋白原专利
本专利技术涉及液体形式的包含稳定纤维蛋白原的组合物，其可用于治疗。专利技术背景纤维蛋白原是血液凝结的必需蛋白质，因为其聚合成为不溶性纤维蛋白，其在控制凝结的级联反应末尾形成，使得形成封闭导致出血的血管裂口的凝块。因此，代替凝块的装置是必要的，以确保止血。此外，形成在伤口上的纤维蛋白形成纤维网络，其确保组织修复，因此瘢痕形成。目前通过使用含有纤维蛋白原的组合物静脉内治疗许多病变。可以提及的是，例如在患有自发性或创伤后出血的患者中的组成性低纤维蛋白原血症、异常血纤维蛋白原血症或无纤维蛋白原血症，在护理获得性低纤维蛋白原血症范围中的严重的不受控制的出血中的额外治疗等。对于某些病变的治疗，使用含有在储存中稳定且即用型的纤维蛋白原的组合物可能是特别有利的。这种施用形式确实为从业者提供了施用上更大的灵活性和速度，改善了出血患者的紧急护理。为此目的，已经开发了含有冷冻干燥的纤维蛋白原的组合物，其储存稳定并且适于快速构建。然而，这种冻干组合物的重构需要几分钟。此外，必须温和地进行重构，以使冷冻干燥物完全溶解，保证产品的浓度，并且不形成将使组合物难以或不能施用的泡沫、浑浊或沉积物。因此，使用这种冷冻干燥的产品在院内或院前急救医学的情况下不是最佳的，在这里每分钟对于治疗出血都很重要。迄今为止，包含纤维蛋白原的组合物以冷冻干燥形式销售以进行重构，特别是在液体稳定性方面不能提供完全满意的效果。具体而言，Chabbat等人(ThrombosisResearch,第76卷,No.6,525-533,1994)描述了含NaCl、氨基己酸、甘氨酸、精氨酸和抑肽酶的纤维蛋白原组合物。抑肽酶作为丝氨酸蛋白酶的天然竞争性抑制剂对于静脉内施用期间的患者是不利的，一方面是从其动物来源(牛肺制备)具有不可忽略的过敏性休克风险的观点来看，且另一方面，其抗凝血活性会加重待治疗患者的凝血缺陷。申请WO0021568描述了包含纤维蛋白原、钙离子、免疫刺激剂和抗纤维蛋白溶解剂的组合物，其用作纤维蛋白粘合剂。然而，这种组合物不能静脉内施用于患者。申请人的申请EP1648496描述了包含纤维蛋白原的组合物，其通过添加精氨酸、柠檬酸三钠、亮氨酸/异亮氨酸和甘氨酸和/或赖氨酸而稳定，从而允许冷冻干燥物的稳定化和溶解。然而，这种组合物不完全适用于纤维蛋白原的液体制剂。在这种情况下，对即用型的包含纤维蛋白原的液体组合物的需求持续存在。申请人开发了一种新的组合物，其包含纤维蛋白原，优选人纤维蛋白原，其在液态下是稳定的。因此，本专利技术涉及液体形式的包含稳定纤维蛋白原的组合物。专利技术概述令人惊讶且有利的是，申请人揭示了使用有限数量和最少量的赋形剂可能获得包含纤维蛋白原的组合物，其随时间推移以液体形式特别稳定。附图简述图1A显示了SEQIDNO:1的适体的预测二级结构。属于碱基序列(SEQIDNO:66)的核苷酸以灰色突出显示。图2A显示了SEQIDNO:58的适体的预测二级结构。属于碱基序列(SEQIDNO:67)的核苷酸以灰色突出显示。框中的环对应于包含式(III)的共有基团的适体的区域。图2B显示了SEQIDNO:67-74的碱基序列的比对。序列被框的部分包括式(III)的共有基团。图3-4显示了通过本专利技术的方法获得的针对人纤维蛋白原的一些适体的结合特性。图3A显示以125nM至1000nM的浓度存在的人血浆纤维蛋白原对固定在芯片上的SEQIDNO：66(SEQIDNO：1的碱基序列)的SPR(表面等离子体共振)结合曲线。在pH6.3注射人血浆纤维蛋白原的每种溶液，使得复合物以剂量依赖性方式形成，如信号增加所示，所述信号的增加取决于纤维蛋白原的浓度。注射含有0.5MNaCl的pH6.3的缓冲溶液没有显著诱导人血浆纤维蛋白原的洗脱。然后通过pH7.40的洗脱缓冲液从复合物中释放出纤维蛋白原。然后通过注射NaOH溶液50mM再生固体支持物。X-轴：以秒计的时间。Y-轴：任意单位的SPR响应。图3B显示以125nM至1000nM的浓度存在的转基因纤维蛋白原对固定在芯片上的SEQIDNO：66(SEQIDNO：1的碱基序列)的SPR结合曲线。在pH6.3注射转基因纤维蛋白原的每种溶液，使得复合物以剂量依赖性方式形成，如信号增加所示，所述信号增加取决于纤维蛋白原的浓度。注射包含NaCl0.5M的pH6.3的缓冲溶液没有显著诱导转基因纤维蛋白原的洗脱。然后通过pH7.40的洗脱缓冲液从复合物中释放纤维蛋白原。然后通过注射NaOH溶液50mM再生固体支持物。X-轴：以秒计的时间。Y-轴：任意单位的SPR响应。图3C显示以125nM至1000nM的浓度存在的人血浆纤维蛋白原对固定在芯片上的SEQIDNO：67(SEQIDNO：58的碱基序列)上的SPR结合曲线。在pH6.3注射人血浆纤维蛋白原的每种溶液，使得复合物以剂量依赖性方式形成，如信号增加所示，所述信号增加取决于纤维蛋白原的浓度。注射含有NaCl1M的pH6.3缓冲溶液没有显著诱导人血浆纤维蛋白原的洗脱。然后通过pH7.40和含有MgCl22M的洗脱缓冲液从复合物中释放出纤维蛋白原。然后通过注射NaOH50mM再生固体支持物。X-轴：以秒计的时间。Y-轴：任意单位的SPR响应。图3D显示以125nM至1000nM的浓度存在的转基因纤维蛋白原对固定在芯片上的SEQIDNO：67(SEQIDNO：58的碱基序列)的SPR结合曲线。在pH6.3注射转基因纤维蛋白原，使得复合物以剂量依赖性方式形成，如信号增加所示，所述信号增加取决于纤维蛋白原的浓度。注射含有NaCl1M的pH6.3缓冲溶液没有显著诱导人血浆纤维蛋白原的洗脱。然后通过pH7.40和含有MgCl22M的洗脱缓冲液从复合物中释放出纤维蛋白原。然后通过注射NaOH50mM溶液再生固体支持物。X-轴：以秒计的时间。Y-轴：任意单位的SPR响应。图4A显示SPR传感图，其显示纤维蛋白原与SEQIDNO：66(SEQIDNO：1的碱基序列)的固定的适体的结合对于pH的依赖性。血浆纤维蛋白原在不同pH注射，在注射样品后，在每次测试时将pH6.30的迁移缓冲液送入流动池。在6.30的pH下获得最高结合水平。当pH增加时，结合水平降低。X-轴：以秒计的时间。Y-轴：任意单位的SPR响应。图4B显示SPR传感图，其显示人血浆纤维蛋白原与SEQIDNO：67(SEQIDNO：58的碱基序列)的适体的结合亲和力对于pH的依赖性。在pH值高于6.8没有观察到结合。X-轴：以秒计的时间。Y-轴：任意单位的SPR响应。图4C显示人血浆纤维蛋白原(传感图)对固定在芯片上的SEQIDNO：60和SEQIDNO：65的适体(属于本专利技术适体的第二亚组)的结合曲线，通过SPR技术获得。在pH6.3注射纯化的人血浆纤维蛋白原(250nM)，使得形成复合物，如信号增加所示。注射包含NaCl0.5M的pH6.3缓冲溶液没有显著诱导人血浆纤维蛋白原的洗脱。然后通过注射NaOH50mM的溶液再生固体支持物。X-轴：以秒计的时间。Y-轴：任意单位的SPR响应。图5A显示了在亲和支持物纯化来自血浆的纤维蛋白原的色谱图，所述亲和支持物上接枝了SEQIDNO：66的适体。Y轴：280nm处的吸光本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.液体形式的包含稳定的纤维蛋白原的组合物。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.07.28 EP 16305984.3;2016.07.28 EP 16305985.0;1.液体形式的包含稳定的纤维蛋白原的组合物。2.根据权利要求1的组合物，其中所述组合物在4℃稳定至少3个月。3.根据权利要求1或2的组合物，其中所述组合物具有高于0.5的可凝结纤维蛋白原/纤维蛋白原抗原比率；优选高于0.6；高于0.7；高于0.8；高于0.9；甚至更优选等于约1.0。4.根据权利要求1-3中任一项的组合物，其中所述组合物在稳定性测试期间保留的纤维蛋白原单体的量高于50％、优选高于60％、优选高于70％、优选高于80％、优选高于90％、优选高于95％的纤维蛋白原单体的初始比率。5.根据权利要求1-4中任一项的组合物，其中所述组合物在稳定性测试期间形成的聚合物的量低于10％、优选低于20％、优选低于30％、优选低于40％、优选低于50％的纤维蛋白原聚合物初始比率。6.根据权利要求1-5中任一项的组合物，其中:-所有α链被保留至少50％、优选至少60％、优选至少70％、优选至少80％、优选至少90％；更优选保留约100％，和/或-所有β链被保留至少50％、优选至少60％、优选至少70％、优选至少80％、优选至少90％；更优选保留约100％，和/或-所有γ链被保持至少50％、优选至少60％、优选至少70％、优选至少80％、优选至少90％；更优选保留约100％。7.根据权利要求1至6中任一项的组合物，其中稳定性测试后测定的浊度低于稳定性测试前测定的浊度的130％、低于120％、低于110％；有利地，相当于100％。8.根据权利要求1至7中任一项的组合物，其中所述组合物不含蛋白酶和/或纤维蛋...

【专利技术属性】
技术研发人员：D·巴塔勒，M·特利尔，
申请(专利权)人：法国血液分割暨生化制品实验室，
类型：发明
国别省市：法国,FR