具有改进的药代动力学的糖基化VWF融合蛋白制造技术

本发明专利技术涉及包含主要蛋白质和一个或多个延伸肽的融合蛋白，其中主要蛋白质的氨基酸序列与哺乳动物蛋白质或其片段的氨基酸序列相同或相似，并且所述延伸肽包含O‑糖基化氨基酸簇。延伸肽与哺乳动物蛋白的非重复序列相同和/或与SEQ ID NO：1相同或相似。主要蛋白质优选地为VWF。与主要蛋白质相比，融合蛋白具有增加的半衰期，并且可以用于增加例如FVIII的结合配偶体的半衰期。本发明专利技术进一步涉及由融合蛋白，编码融合蛋白的多核苷酸以及包含该多核苷酸的载体和宿主细胞形成的复合物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】具有改进的药代动力学的糖基化VWF融合蛋白
本专利技术涉及蛋白质的半衰期延长，特别是人凝血因子如血管性血友病因子(VWF)和因子VIII(FVIII)。
技术介绍
血友病是一组损害身体控制血液凝固或凝血的能力的遗传性疾病。在其最常见的形式血友病A中，凝血因子VIII(FVIII)是缺乏的。血友病A在5,000-10,000个男性出生儿中有约1个发生。FVIII蛋白是血液凝固中具有多功能特性的必需辅助因子。FVIII的缺乏可以用血浆衍生的FVIII浓缩物或用重组产生的FVIII治疗。用FVIII浓缩物治疗可令血友病患者正常生活。血友病A患者根据需要用FVIII治疗或作为每周施用数次的预防性治疗进行治疗。对于预防性治疗，施用15-25IU/kg体重的FVIII，每周三次，这因为对FVIII的持续需要及其在血液系统中的短的半衰期的缘故而是必要的，上述半衰期在人体中仅为约11小时(Ewenstein等,2004)。在血液中，在正常条件下，FVIII分子总是与其辅因子血管性血友病因子(VWF)相关，其使FVIII分子稳定免于不同形式的降解。FVIII和VWF的非共价复合物具有0.2-0.3nM的高结合亲和力(Vlot等,1996)。在历史上，血友病A已经用源自人血浆的FVIII治疗。然而，自20世纪90年代以来，市售了不同的重组产生的FVIII蛋白。然而，血浆衍生的和重组产生的FVIII蛋白都不具有最佳的药代动力学特性。与许多其他治疗性蛋白质一样，它们受到肽酶的代谢更新的影响，这显著限制了它们的体内半衰期。如Tiede等(2015)评论，延长FVIII半衰期的尝试包括Fc融合(Eloctate、Elocta、efmoroctocogα)，添加聚乙二醇(turoctocogαpegol[N8-GP]、BAY94-9027、BAX855)和单链构建体(CSL627)。所有这些技术改变FVIII分子并得到半衰期延长约1.5倍的FVIII。FVIII的进一步半衰期延长限于VWF半衰期。如Yee等人所示，人VWFD`D3结构域足以稳定血浆中的FVIII。然而，D’D3-Fc融合蛋白仅能在VWF-/-小鼠中延长FVIII半衰期。在血友病A小鼠中，D’D3-Fc构建体由于蛋白质片段与内源性VWF对FVIII结合的无效竞争而不会导致FVIII半衰期延长。WO2014/011819A2描述了含有VWF的D’D3结构域，XTEN和IgG的Fc结构域的FVIII构建体的成功半衰期延长。由于该构建体不与内源性VWF结合，因此在VWF/FVIII-双敲除(DKO)和血友病A小鼠中均观察到相同的半衰期延长效应。然而，尽管体外功能完全，但其在体内显示出显著降低的活性。用于增加治疗性蛋白质的半衰期的其他方法包括治疗性蛋白质与具有天然长半衰期的蛋白质如转铁蛋白和白蛋白的遗传融合，或与蛋白质结构域如绒毛膜促性腺激素(CG)的C-末端肽(CTP)的遗传融合。CG属于糖蛋白激素家族，其包括促黄体激素(LH)、促卵泡激素(FSH)和促甲状腺激素(TSH)。这些糖激素是异二聚体并由共同的α-亚基和赋予它们不同活性的独特的β-亚基组成。人CG(hCG)的半衰期显著比其对应物LH、FSH和TSH的半衰期更长。这表明，hCG-β的O-糖基化CTP是造成这种半衰期延长的原因。CTP被描述为由序列FQSSSS*KAPPPS*LPSPS*RLPGPS*DTPILPQ组成，其具有四个O-糖基化位点(由S*表示)(Birken等,1977)。如Strohl等(2015)所述，已经开发了治疗性蛋白质和CTP的不同融合蛋白，并且目前正在临床试验中。治疗性蛋白质包括FSHFVIIa、FIX、IFN-β和胃肠激素。
技术实现思路
本专利技术尤其基于以下发现：将O-糖基化氨基酸簇(其存在于全长人VWF中)添加到VWF片段中导致其半衰期显著增加。与不具有额外O-聚糖簇的VWF片段相比，融合蛋白的半衰期延长。因此，根据第一方面，本专利技术涉及一种包含主要蛋白质和至少一个延伸肽的融合蛋白，其中主要蛋白质的氨基酸序列与哺乳动物蛋白质如VWF或其片段的氨基酸序列相同或相似，所述延伸肽包含O-糖基化氨基酸簇。令人关注的是，被加成到VWF的片段中的包含O-糖基化氨基酸簇的延伸肽就是衍生自该蛋白质本身，即VWF。因此，申请人已经确定了延长蛋白质半衰期的一般原则。该一般原理是将蛋白质的O-糖基化氨基酸的内在簇添加到所述蛋白质或其片段中。因此，根据第一方面的融合蛋白的优选实施例，一个或多个延伸肽的氨基酸序列与所述哺乳动物蛋白或片段的非重复氨基酸序列部分相同或相似，特别是所述主要蛋白质。本专利技术人的发现的进一步结论是由SEQIDNO：1鉴定的VWF的O-糖基化氨基酸簇可用作半衰期延伸肽。由于半衰期延长性质不限于VWF，根据第一方面的另一优选实施例，一个或多个延伸肽与VWF的O-糖基化肽具有至少90％，优选地至少95％，更优选地至少98％，最优选地至少100％的序列同一性，特别是SEQIDNO：1。在第二方面中，本专利技术涉及一种编码根据第一方面的融合蛋白的多核苷酸。根据第三方面，本专利技术涉及一种含有根据第二方面的多核苷酸的载体。在第四方面中，本专利技术涉及一种含有根据第二方面的多核苷酸或根据第三方面的载体的宿主细胞，其中该宿主细胞是哺乳动物细胞。专利技术人发现，不仅VWF的半衰期增加，而且其结合配偶体FVIII的半衰期也增加。因此，根据第五方面，本专利技术涉及根据第一方面的融合蛋白用于增加第二蛋白的半衰期的用途，其中所述融合蛋白能够与所述第二蛋白结合。因此，在所得的融合蛋白和第二蛋白质的复合物或组合物中，第二蛋白质也具有增加的半衰期。因此，在第六方面中，本专利技术涉及一种第一蛋白质和第二蛋白质的组合物，其中所述第一蛋白质是根据第一方面的融合蛋白并且能够结合所述第二蛋白质，并且所述第二蛋白质是治疗性蛋白质，其包含与第二哺乳动物蛋白质或其片段的氨基酸序列相同或相似的氨基酸序列。并且根据第七方面，本专利技术涉及一种第一蛋白质和第二蛋白质的复合物，其中所述第一蛋白质是根据第一方面的融合蛋白，并且所述第二蛋白质具有与第二哺乳动物蛋白质或其片段的氨基酸序列相同或相似的氨基酸序列。最后，在第八方面中，本专利技术还涉及一种药物组合物，其包含根据第一方面的融合蛋白，根据第六方面的组合物，或根据第七方面的复合物，其用于治疗或预防出血性疾病，优选地选自PUP治疗，或ITI治疗和其他相关出血性疾病治疗。附图说明图1显示以下的的示意图：A)VWF片段OCTA11，和B)根据本专利技术的融合蛋白，其中VWF片段作为主要蛋白质：OCTA12；C)根据本专利技术的融合蛋白，其中VWF片段作为主要蛋白质：OCTA14；D)根据本专利技术的融合蛋白，其中VWF片段作为主要蛋白质：OCTA15。图2显示静脉内施用与不同VWF蛋白或血浆衍生的全长VWF共同配制的FVIII后FVIII/VWF双敲除(DKO)小鼠血浆中的FVIII活性的时间进程。数据点和误差条表示5个值的平均值和标准偏差(SD)。由于尺寸小，有些误差条是不可辨别的。图3显示了皮下施用与OCTA12共同配制的100U/kgFVIII后小型猪血浆中的OCTA12抗原浓度的时间进程。图4显示了皮下和静脉内注射100U/kgFV本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种融合蛋白，其包含主要蛋白质和一个或多个延伸肽，其中所述主要蛋白质的氨基酸序列与哺乳动物蛋白质或其片段的氨基酸序列相同或相似，并且所述延伸肽包含O‑糖基化氨基酸簇。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.05.20 EP 16170690.81.一种融合蛋白，其包含主要蛋白质和一个或多个延伸肽，其中所述主要蛋白质的氨基酸序列与哺乳动物蛋白质或其片段的氨基酸序列相同或相似，并且所述延伸肽包含O-糖基化氨基酸簇。2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白与不含延伸肽的主要蛋白质相比具有增加的半衰期。3.根据权利要求1或2所述的融合蛋白，其中所述一个或多个延伸肽的所述氨基酸序列与所述主要蛋白质或片段的非重复氨基酸序列部分相同或相似。4.根据前述权利要求中任一项所述的融合蛋白，条件是所述一个或多个延伸肽不衍生自绒毛膜促性腺激素β-亚基(CG-β)，特别是与CG-β的C-末端肽(CTP)并不相同或相似。5.根据前述权利要求中任一项所述的融合蛋白，其中所述延伸肽的O-糖基化氨基酸簇含有至少两个、优选为至少三个、更优选为至少四个O-糖基化氨基酸。6.根据前述权利要求中任一项所述的融合蛋白，其中所述O-糖基化位点簇含有至少一个苏氨酸作为O-糖基化氨基酸，优选地所述簇含有苏氨酸和丝氨酸作为O-糖基化氨基酸。7.根据前述权利要求中任一项所述的融合蛋白，其中所述一个或多个延伸肽在10个氨基酸中含有至少一个O-糖基化位点，优选地在8个氨基酸中含有至少一个O-糖基化位点。8.根据前述权利要求中任一项所述的融合蛋白，其中所述一个或多个延伸肽的长度为20至60个氨基酸，优选为22至40个氨基酸，更优选为26至36个氨基酸。9.根据前述权利要求中任一项所述的融合蛋白，其中所述一个或多个延伸肽与血管性血友病因子(VWF)的O-糖基化肽具有至少90％的序列同一性。10.根据权利要求9所述的融合蛋白，其中所述一个或多个延伸肽与特别是SEQIDNO：1的VWF的O-糖基化肽具有至少90％、优选为至少95％、更优选为至少98％、最优选为至少100％的序列同一性。11.根据前述权利要求中任一项所述的融合蛋白，其包含延伸肽的至少两个拷贝、优选地至少四个拷贝。12.根据前述权利要求中任一项所述的融合蛋白，其中延伸肽直接或间接与所述主要蛋白质的C-末端融合。13.根据前述权利要求中任一项所述的融合蛋白，其中延伸肽形成所述融合蛋白的C-末端，其中所述延伸肽的所述C-末端氨基酸任选地与亲和标签融合肽连接。14.根据权利要求9至13中任一项所述的融合蛋白，其中所述主要蛋白质包含至少一个O-糖基化氨基酸簇。15.根据前述权利要求中任一项所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含二聚化结构域，特别是所述主要蛋白质包含二聚化结构域。16.根据前述权利要求中任一项所述的融合蛋白，其中所述哺乳动物蛋白是人血蛋白，优选地凝血因子或蛋白酶抑制剂，更优选地选自VWF、凝血酶原、纤维蛋白原、FIII、FV、FVII、FVIII、FIX、FX、FXI、FXII、FXIII、ADAMTS13、抗凝血酶、α-1抗胰蛋白酶、C1-抑制剂、抗胰凝乳蛋白酶、PAI-1、PAI-3、2-巨球蛋白、TFPI、肝素辅因子II蛋白Z、蛋白C、以及蛋白S。17.根据前述权利要求中任一项所述的融合蛋白，其中所述主要蛋白质与SEQIDNO：2的氨基酸764至1268具有至少90％、优选为至少95％、更优选为至少98％、最优选为100％的序列同一性。18.根据前述权利要求中任一项所述的融合蛋白，其中与所述主要蛋白质相比，所述融合蛋白包含至少4个、优选为至少8个、更优选为至少12个额外的O-聚糖。19.根据前述权利要求中任一项所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白的氨基酸序列与选自SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10或SEQIDNO:11的序列具有至少90％、优选为至少95％、更优选为至少98％、最优选为100％的同一性。20.根据前述权利要求中任一项所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白通过在哺乳动物细胞系中表达而产生，优选为人细胞系，更优选为人肾细胞系，最优选为人胚肾...

【专利技术属性】
技术研发人员：克里斯托夫·坎尼希特，巴巴拉·索尔卡维图尔斯卡，斯特凡·温厄，蒂洛·施维恩泰克，
申请(专利权)人：瑞士奥克特珐玛公司，
类型：发明
国别省市：瑞士,CH