从血液产品分离因子VIII的方法技术

本发明专利技术提供了从包含因子VIII(FVIII)蛋白和血管性血友病因子(vWF)蛋白的第一组合物中分离FVIII蛋白的方法，所述FVIII蛋白至少含有FVIII的轻链，所述血管性血友病因子(vWF)蛋白至少包含vWF的FVIII结合结构域，其中所述FVIII蛋白可以与所述vWF蛋白形成复合物，所述方法包括以下步骤：使所述第一组合物与包含配体和基质的亲和树脂接触，其中所述配体对FVIII的轻链具有亲和力，并将所述亲和树脂与混合物分离，得到第二组合物和改性的第一组合物，其中第二组合物含有所述亲和树脂以及所述FVIII蛋白与所述vWF蛋白的复合物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】从血液产品分离因子VIII的方法专利
本专利技术涉及从包含因子VIII蛋白和血管性血友病因子蛋白的第一组合物中，特别是血浆中，分离因子VIII的方法，并涉及方法产品，即具有减少量的FVIII和/或FVIII/vWF复合物的血液产品。专利技术背景血友病是一组遗传性遗传疾病，其损害身体控制血液凝结或凝固的能力。在其最常见的形式血友病A中，凝固因子VIII(FVIII)是缺乏的，血友病A在每5,000至10,000个男性新生儿中发生1例。FVIII蛋白是血液凝固中的必需辅助因子，具有多功能特性。可以用源自血浆的FVIII浓缩物或用重组产生的FVIII治疗FVIII缺乏。用FVIII浓缩物治疗的血友病患者可正常生活。历史上，血友病A已经用源自人血浆的FVIII治疗。在血浆中，在正常条件下，FVIII分子总是与其辅因子血管性血友病因子(vWF)结合，所述辅因子使FVIII分子稳定免于不同形式的变性。已经描述了许多方法用于从血浆或重组产生因子VIII(rFVIII)的培养物中纯化因子VIII，存在或不存在血管性血友病因子。通常，具有少量vWF的纯化的FVIII产物含有添加的人白蛋白和/或其他稳定剂(包括钙离子和增加的盐浓度)以稳定FVIII分子。用于从血浆中纯化FVIII的方法通常是不同沉淀方法的组合，例如低温沉淀，氢氧化铝沉淀等，以及色谱步骤，主要是离子交换、亲和以及凝胶过滤步骤。为了改进FVIII产物，使用亲和色谱法，其有效地将污染物移除从而高度纯度FVIII，还包括降低vWF的可能(Farrugia等，1993)。在90年代，第一种重组FVIII(rFVIII)产品在市场上销售，分为全长rFVIII分子，模拟血浆中FVIII的主要形式，以及B结构域缺失的rFVIII分子(Eriksson等，2001)，其中一个非活性部分(B-结构域)已被除去，这两者都具有高纯度(均不含vWF)。rFVIII也通过几个纯化步骤纯化，包括亲和色谱，如WO2009/156430和McCue等，2009所述。这些文献公开了使用亲和色谱步骤纯化重组产生的因子VIII(不存在血管性血友病因子)，使用基于非动物衍生的Fab片段的亲和树脂，其中13kD配体结合至因子VIII的轻链(参见Winge等，2015)。生物活性因子VIII可以用不同的体外分析方法(FVIII：C)测量，例如FVIII生色测定和/或一阶段凝块测定(Girma等，1998)。生色测定法是两阶段光度测定法，其测量因子VIII作为FIXa的辅因子的生物活性。在该方法中，FX在钙离子和磷脂的存在下被FIXa活化为FXa。形成的FXa将生色底物切割成产物，其可以通过分光光度法定量。一阶段凝块测定基于含有因子VIII的样品在磷脂、接触活化剂和钙离子存在下校正缺乏因子VIII的血浆的凝固时间的能力。在一步中测量出现纤维蛋白凝块的时间。为了测试rFVIII或纯化的FVIII样品，通常使用先天性FVIII缺乏型血浆，例如来自Helena生物科学公司的固有“因子VIII缺乏血浆(先天性)”。然而，这些先天性血浆的可用性是有限的，因为它来自血友病A患者，因此这些血浆的量是有限的。还可以通过从正常血浆中去除FVIII来产生FVIII缺乏型血浆，即使用对FVIII/vWF复合物特异的抗体从血浆中去除FVIII/vWF复合物，所述抗体通常是针对FVIII的亲和配体，其不受vWF至FVIII的结合的干扰。示例是的AffinityBioogicalsTM公司的因子VIII缺乏型血浆。
技术实现思路
本专利技术基于但不限于以下令人惊讶的发现：对FVIII轻链特异的配体，特别是以名称“VIIISelect”出售的基于Fab片段的亲和树脂，在限定条件下有效地结合至FVIII和vWF的复合物。本专利技术人能够确定结合的特定最佳条件。因此，根据第一方面，本专利技术提供了从包含因子VIII(FVIII)蛋白和vWF蛋白的第一组合物中分离FVIII蛋白的方法，所述FVIII蛋白至少含有FVIII的轻链，所述vWF蛋白至少包含vWF的FVIII结合结构域，其中所述FVIII蛋白可以与所述vWF蛋白形成复合物，所述方法包括以下步骤：-使所述第一组合物与包含配体和基质的亲和树脂接触，其中所述配体对FVIII的轻链具有亲和力，和-将所述亲和树脂与混合物分离，得到第二组合物和改性的第一组合物，其中第二组合物含有所述亲和树脂、FVIII以及所述FVIII蛋白与所述vWF蛋白的复合物。重要的是，不仅FVIII与配体结合。本专利技术人已经确定了FVIII与vWF复合的结合条件，因此可以将FVIII/vWF复合物与血液产品，特别是血浆分离。因此，根据第二方面，本专利技术提供了一种用于生产改性的血液产品的方法，包括以下步骤：-提供包含血液产品，特别是血浆的第一组合物；-根据本专利技术的第一方面进行FVIII的分离；和-收集改性的血液产品。因此，在第三方面，本专利技术提供了通过根据第二方面的方法获得的经改性的血浆，其中FVIII的浓度小于健康人类供体的血浆的平均FVIII浓度的4％。具有减少量的FVIII的改性的血浆，特别是FVIII缺乏型血浆，可用于治疗疾病或病症，例如弥散性血管内凝血(DIC)或败血症。因此，根据第四方面，本专利技术提供用于治疗的改性的血浆，其中所述改性的血浆根据本专利技术第三方面定义。然而，根据第三方面的改性的血液产品的替代应用是在FVIII样品的分析测试中的应用。基于此，根据第五方面，本专利技术提供了改性的血液产品，特别是根据本专利技术的第三方面的改性的血浆用于测试样品中FVIII的浓度和/或活性的用途。根据第一方面的分离方法不仅可用于从血液产品样品中分离血液衍生的FVIII，而且还可用于纯化FVIII，vWF或其复合物。因此，根据第六方面，本专利技术提供了纯化或富集FVIII蛋白、vWF蛋白或FVIII蛋白与vWF蛋白的复合物的方法，包括以下步骤：-提供包含FVIII蛋白和vWF蛋白的第一组合物，所述FVIII蛋白至少含有FVIII的轻链，所述vWF蛋白至少包含vWF的FVIII结合结构域，其中FVIII蛋白可与vWF蛋白形成复合物，-进行根据第一方面的分离方法；-任选地对第二组合物进行至少一个洗涤步骤，其中第二组合物含有亲和树脂和FVIII蛋白与vWF蛋白的复合物；和-任选地洗脱包含vWF的第三组合物，特别是用包含CaCl2的洗脱缓冲液洗脱；和-从亲和树脂中洗脱第四组合物，其包含FVIII蛋白与vWF蛋白的复合物或FVIII蛋白。最后，根据第七方面，本专利技术提供了一种组合物，其包含通过根据第六方面的方法获得的FVIII蛋白与vWF蛋白的复合物或纯化的FVIII蛋白，或纯化的vWF蛋白。附图说明图1显示了分批吸附图，测量了在用亲和树脂VIIISelect经过不同孵育时间后血浆中FVIII的浓度。FVIII浓度显示在Y轴上，时间示于X轴上。在血浆与VIIISelect混合之前、4小时后和24小时后测量血浆样品中的FVIII浓度。该图的图例显示了VIIISelect材料(g)与血浆体积(ml)的比例。指示的温度(20-25℃)显示孵育温度。图2显示了使用VIIISelect和OctaplasTM作为起始材料的分批吸附实验的图。血液产品中FVIII的浓度显示在本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种从包含因子VIII(FVIII)蛋白和血管性血友病因子(vWF)蛋白的第一组合物中分离FVIII蛋白的方法，所述FVIII蛋白至少包含FVIII的轻链，所述血管性血友病因子(vWF)蛋白至少包含vWF的FVIII结合结构域，其中所述FVIII蛋白可以与所述vWF蛋白形成复合物，所述方法包括以下步骤：‑使所述第一组合物与包含配体和基质的亲和树脂接触，其中所述配体对FVIII的轻链具有亲和力，和‑将所述亲和树脂与混合物分离，得到第二组合物和改性的第一组合物，其中第二组合物含有所述亲和树脂以及所述FVIII蛋白与所述vWF蛋白的复合物。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.02.11 EP 16155199.91.一种从包含因子VIII(FVIII)蛋白和血管性血友病因子(vWF)蛋白的第一组合物中分离FVIII蛋白的方法，所述FVIII蛋白至少包含FVIII的轻链，所述血管性血友病因子(vWF)蛋白至少包含vWF的FVIII结合结构域，其中所述FVIII蛋白可以与所述vWF蛋白形成复合物，所述方法包括以下步骤：-使所述第一组合物与包含配体和基质的亲和树脂接触，其中所述配体对FVIII的轻链具有亲和力，和-将所述亲和树脂与混合物分离，得到第二组合物和改性的第一组合物，其中第二组合物含有所述亲和树脂以及所述FVIII蛋白与所述vWF蛋白的复合物。2.如权利要求1所述的方法，其中所述FVIII蛋白选自：人血浆衍生的FVIII，天然存在于人血液中的FVIII衍生物、重组人全长FVIII和重组人B结构域缺失的FVIII。3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述vWF蛋白选自：人血浆衍生的vWF多聚体，人血浆衍生的vWF单体和重组人全长vWF。4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中配体是多肽，优选重组多肽，更优选在非动物来源中产生的重组多肽，特别是在酵母细胞中产生的重组多肽。5.如权利要求4所述的方法，其中所述配体是抗体Fab片段，优选13kDFab片段。6.如权利要求5所述的方法，其中所述基质由高度交联的琼脂糖组成，并且优选所述亲和树脂是VIIISelect。7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中在填充柱上连续进行分离，并且第一组合物和/或改性的第一组合物的流速等于或低于30cm/小时，优选等于或低于15cm/小时，更优选等于或低于10cm/小时，特别是等于或低于7.5cm/小时。8.如权利要求7所述的方法，其中基于所述第一组合物的总体积，所述第一组合物中的FVIII蛋白的浓度等于或低于1IU/mL，优选等于或低于0.7IU/mL，更优选等于或低于0.4IU/mL，最优选等于或低于0.2IU/mL。9.如权利要求6-7中任一项所述的方法，其中所述第一组合物的体积与所述树脂的体积的比率为5:1至100:1，优选10:1至70:1，更优选10:1至50:1，特别是20:1至40:1。10.如权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：斯特凡·温厄，P·罗森，A·希珀斯，
申请(专利权)人：瑞士奥克特珐玛公司，
类型：发明
国别省市：瑞士,CH