淀粉样β-蛋白前体抑制剂结构域的变体制造技术

提供了在抑制中胰蛋白酶和/或激肽释放酶‑6中有效的淀粉样∮‑蛋白前体抑制剂结构域(APPI)的变体，以及包括其的组合物。进一步，提供了所述肽或组合物的使用方法，包括但不限于治疗癌症。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】淀粉样β-蛋白前体抑制剂结构域的变体相关申请的交叉引用本申请要求2015年12月10日提交的美国临时专利申请号62/265,719和2016年3月28日提交的美国临时专利申请号62/313,824的优选权权益，其内容通过引用以其全部并入本文。
本专利技术涉及在抑制特异性丝氨酸蛋白酶比如中胰蛋白酶(mesotrypsin)和/或激肽释放酶-6中有效的源自淀粉样∮-蛋白前体抑制剂结构域(APPI)的肽，以及其使用方法，包括但不限于治疗恶性疾病，等等。
技术介绍
人淀粉样∮-蛋白前体抑制剂(APPI)，还称为蛋白酶连接蛋白-2，是分泌形式的淀粉样∮-蛋白前体(APP)。APPI包含被称为KPI(Kunitz蛋白酶抑制剂)的Kunitz丝氨酸蛋白酶抑制剂结构域。丝氨酸蛋白酶是切割蛋白质中的肽键的酶，其中丝氨酸充当酶活性位点处的亲核性氨基酸。丝氨酸蛋白酶参与各种代谢途径。在人中，它们负责协调多种生理学功能，包括消化、免疫应答、凝血和繁殖。数种研究已经展现了特异性丝氨酸蛋白酶的异常调控在病理学状况比如恶性肿瘤的发生和转移侵袭力中发挥作用。人激肽释放酶6(hK6)是人激肽释放酶丝氨酸蛋白酶家族的成员。其是具有胰蛋白酶样活性的223个氨基酸的蛋白酶，具有精氨酸特异性消化能力。研究已经显示hK6高表达与许多种类的恶性肿瘤——包括乳腺癌、结肠癌和卵巢癌——的发生高度关联。在这些和其它研究中，hK6被发现介导恶性细胞的增殖、迁移和侵袭力。而且，通过消化髓鞘显示在脑恶性肿瘤中具有显著作用。在癌症模型中，抑制hK6导致癌细胞的较低侵略性行为。在多发性硬化(MS)模型中，hK6抑制导致症状的延迟发作和降低的严重度。因而，对hK6的高度特异性抑制剂存在需要，其抑制hK6蛋白水解活性，同时避免其通过hK6的自我切割。在目前已知参与病理学状况的人丝氨酸蛋白酶之中，中胰蛋白酶是不寻常的并且在阐明作用机制和设计有效的抑制剂方面是明显挑战性的。虽然其具体的病理学作用还未完全阐明，但是中胰蛋白酶的调控异常和过表达与许多人肿瘤中的不良预后和癌症模型中的恶性性状关联，使得此蛋白质成为治疗性介入的引人注目的靶标。中胰蛋白酶作为转移性前列腺癌中的靶标是特别引人注目的，其中在患者中，它在转移性肿瘤中上调并且与复发和转移相关联，而在细胞培养和原位小鼠模型中，发现驱动侵袭性和转移性表型(Hockla,A.,etal.,MolCancerRes,2012.10(12):p.1555-66)。同样，在胰腺癌中，中胰蛋白酶表达与较差的患者存活关联，并且在细胞培养和动物模型中发现促进癌细胞增殖、侵袭、和转移(Jiang,G.,etal.,Gut,2010.59(11):p.1535-44)。中胰蛋白酶的强力的和选择性的抑制剂可以给患有攻击性、转移性癌症的患者的治疗提供保证，并且还将提供工具以在癌症进展和转移中更好地剖析中胰蛋白酶功能。在最近十年期间，中胰蛋白酶已经显现作为不同阶段的癌症发展中显著的参与者，并且已经与多种癌症——包括肺癌、结肠癌、乳腺癌、胰腺癌和前列腺癌——中的细胞恶性相关联。非小细胞肺癌(NSCLC)培养中跨内皮迁移的早期研究显示，中胰蛋白酶过表达与侵袭和转移相关联，同时取自NSCLC患者的细胞的比较微阵列试验显示，中胰蛋白酶过表达预测差的存活。研发将靶向中胰蛋白酶的抑制剂存在特殊的挑战，尤其是由于此酶抵抗许多多肽丝氨酸蛋白酶抑制剂的抑制，并且进一步切割和失活作为生理学底物的许多这样的抑制剂。另外的挑战由需要选择性抑制剂而存在，这是由于中胰蛋白酶显示了与主要消化胰蛋白酶(阳离子和阴离子胰蛋白酶)，以及其它丝氨酸蛋白酶——包括激肽释放酶和凝血因子——的高序列同源性和结构相似性。因而，目前不存在具有高稳定性、亲和力和对人中胰蛋白酶的特异性的有效的抑制剂是不令人惊讶的。虽然中胰蛋白酶和其它胰蛋白酶共享有助于其特异性的相同残基，但是中胰蛋白酶展示有助于其对胰蛋白酶抑制剂的独特抗性的独有的序列和结构特征。此抗性最显著地是由于中胰蛋白酶中两种进化性突变：将Gly-193置换为Arg，其与抑制剂在空间上冲突，和将Tyr-39置换为Ser，其阻止氢键在中胰蛋白酶/抑制剂复合物内的形成。这些突变因此负责中胰蛋白酶(相对于一般的胰蛋白酶)对多肽胰蛋白酶抑制剂不寻常低的亲和力。它们还负责中胰蛋白酶以加速的速率切割数种典型的胰蛋白酶抑制剂的更令人惊讶的能力。中胰蛋白酶的此独有的特征可以由如下事实解释：与其它一般的胰蛋白酶对比，对中胰蛋白酶的抑制剂亲和力——而非其切割——是限速步骤。中胰蛋白酶和抑制剂的典型结合环(bindingloop)之间有利的相互作用(Tyr39Ser)的减弱和不利的相互作用(Gly193Arg)的促进导致在由中胰蛋白酶切割抑制剂之后从活性位点驱逐结合环，从而阻碍切割的抑制剂的再缔合。丝氨酸蛋白酶抑制剂对中胰蛋白酶的蛋白水解稳定性和结合亲和力的显著差异的最突出的实例在于人淀粉样前体蛋白抑制剂结构域(APPI)和牛胰腺胰蛋白酶抑制剂(BPTI)之间的差异，其二者是天然的Kunitz丝氨酸蛋白酶抑制剂。虽然二者充当中胰蛋白酶的潜在抑制剂，但是BPTI是两种中更稳定的(Knecht,W.,etal.,JBiolChem,2007.282(36):p.26089-100)。APPI被非常快速地切割，其中动力学概况更接近地类似底物的动力学概况(Radisky,E.S.,etal.,Biochemistry,2003.42(21):p.6484-92)。两种抑制剂还显示了中胰蛋白酶亲和力的突出差异，其中APPI与BPTI相比100倍更紧密地结合至蛋白酶(Grishina,Z.,etal.,BrJPharmacol,2005.146(7):p.990-9)。对治疗或减轻恶性疾病的更有效的手段存在长期需要。
技术实现思路
本专利技术提供了淀粉样前体蛋白抑制剂结构域(APPI)变体，以及包括其的药物组合物。本专利技术进一步提供了治疗、减轻或抑制中胰蛋白酶相关恶性肿瘤和/或激肽释放酶-6相关恶性肿瘤——包括但不限于前列腺癌——的方法。根据一方面，本专利技术提供了分离的多肽，其包括SEQIDNO:1的氨基酸序列：(EVCSEQAEX1GPCRAX2X3X4RWYFDVTEGX5CAPFX6YGGCGGNRNNFDTEEYCMAVCGSAI)，其中：X1是苏氨酸、丝氨酸、半胱氨酸或缬氨酸；X2是甘氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、组氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸或丙氨酸；X3是苯丙氨酸、亮氨酸、酪氨酸或色氨酸；X4是丝氨酸或苯丙氨酸；X5是赖氨酸、异亮氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸；和X6是缬氨酸、半胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸，或其片段、衍生物或类似物。根据另一个实施方式，分离的多肽包括SEQIDNO:2的氨基酸，其中X1是苏氨酸、丝氨酸、半胱氨酸或缬氨酸；X2是甘氨酸、半胱氨酸或丙氨酸；X3是苯丙氨酸、亮氨酸、酪氨酸或色氨酸；X4是丝氨酸；X5是赖氨酸、异亮氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸；和X6是缬氨酸、半胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸，或其片段、衍生物或类似物。根据另一个实施方式，分离的多肽包括SEQIDNO:3的氨基酸，其中：X1是苏氨酸或缬氨酸；X2是甘氨酸；X3是苯丙氨酸；X4是丝氨酸；X5是本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.分离的多肽，其包括SEQ ID NO:1(EVCSEQAEX1GPCRAX2X3X4RWYFDVTEGX5CAPFX6YGGCGGNRNNFDTEE YCMAVCGSAI)的氨基酸，其中：X1是苏氨酸、丝氨酸、半胱氨酸或缬氨酸；X2是甘氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、组氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸或丙氨酸；X3是苯丙氨酸、亮氨酸、酪氨酸或色氨酸；X4是丝氨酸或苯丙氨酸；X5是赖氨酸、异亮氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸；和X6是缬氨酸、半胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸；或其片段、衍生物或类似物。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.12.10 US 62/265,719;2016.03.28 US 62/313,8241.分离的多肽，其包括SEQIDNO:1(EVCSEQAEX1GPCRAX2X3X4RWYFDVTEGX5CAPFX6YGGCGGNRNNFDTEEYCMAVCGSAI)的氨基酸，其中：X1是苏氨酸、丝氨酸、半胱氨酸或缬氨酸；X2是甘氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、组氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸或丙氨酸；X3是苯丙氨酸、亮氨酸、酪氨酸或色氨酸；X4是丝氨酸或苯丙氨酸；X5是赖氨酸、异亮氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸；和X6是缬氨酸、半胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸；或其片段、衍生物或类似物。2.权利要求1所述的分离的多肽，其中X1是苏氨酸、丝氨酸、半胱氨酸或缬氨酸；X2是甘氨酸、半胱氨酸或丙氨酸；X3是苯丙氨酸、亮氨酸、酪氨酸或色氨酸；X4是丝氨酸；X5是赖氨酸、异亮氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸；和X6是缬氨酸、半胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸，或其片段、衍生物或类似物。3.权利要求1所述的分离的多肽，其中X1是苏氨酸或缬氨酸；X2是甘氨酸；X3是苯丙氨酸；X4是丝氨酸；X5是赖氨酸或亮氨酸；X6是缬氨酸，或其片段、衍生物或类似物。4.权利要求1所述的分离的多肽，其中X1是半胱氨酸、缬氨酸或苏氨酸；X2是甘氨酸或半胱氨酸；X3是苯丙氨酸；X4是丝氨酸；X5是赖氨酸或亮氨酸；和X6是半胱氨酸，或其片段、衍生物或类似物。5.权利要求1所述的分离的多肽，其中X1是苏氨酸；X2是甘氨酸、亮氨酸、组氨酸、丝氨酸或苯丙氨酸；X3是苯丙氨酸；X4是丝氨酸或苯丙氨酸；X5是赖氨酸；和X6是缬氨酸，或其片段、衍生物或类似物。6.权利要求1所述的分离的多肽，其中X1是苏氨酸；X2是甘氨酸或亮氨酸；X3是苯丙氨酸；X4是丝氨酸或苯丙氨酸；X5是赖氨酸；和X6是缬氨酸，或其片段、衍生物或类似物。7.权利要求1所述的分离的多肽，其中X1是苏氨酸；X2是亮氨酸；X3是苯丙氨酸；X4是丝氨酸或苯丙氨酸；X5是赖氨酸；和X6是缬氨酸，或其片段、衍生物或类似物。8.权利要求1所述的分离的多肽，其包括如SEQIDNO:8(EVCSEQAETGPCRAGFSRWYFDVTEGKCAPFVYGGCGGNRNNFDTEEYCMAVCGSAI)中陈述的氨基酸序列，或其片段、衍生物或类似物。9.权利要求1所述的分离的多肽，其包括如SEQIDNO:9(EVCSEQAEVGPCRAGFSRWYFDVTEGKCAPFVYGGCGGNRNNFDTEEYCMAVCGSAI)中陈述的氨基酸序列，或其片段、衍生物或类似物。10.权利要求1所述的分离的多肽，其包括如SEQIDNO:10(EVCSEQ...

【专利技术属性】
技术研发人员：N·帕波，I·科恩，A·萨纳诺斯，
申请(专利权)人：国家生物技术研究所公司，
类型：发明
国别省市：以色列,IL