TSM1多肽及其在制备抗补体药物中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种来源于猪肉绦虫的TSM1多肽。采用基因工程技术，经设计引物，克隆，表达纯化得到TSM1蛋白，通过经典途径补体溶血实验确定TSM1抗补体功能。TSM1多肽由63个氨基酸组成，编码该蛋白的基因全长189bp，该蛋白的理论分子量9820Da，有3对二硫键，包含1个Kunitz结构域，理化性质稳定。本发明专利技术为寻找补体对抗靶点及抗补体天然药物奠定基础，为抗补体天然药物研发提供了新的先导分子，TSM1有望成为在经典途径中抗补体的天然新药。

【技术实现步骤摘要】
TSM1多肽及其在制备抗补体药物中的应用
本专利技术属于基因工程和生物医药医疗领域，具体涉及来源于猪肉绦虫的TSM1多肽及其在制备抗补体药物中的应用。
技术介绍
猪肉绦虫(Taeniasolium)又称猪带绦虫、链状绦虫、有钩绦虫，绦虫纲，带形科，分布广泛，但是其感染率不高。猪肉绦虫是人畜共患的寄生蠕虫，人体是该虫唯一的终宿主。猪肉绦虫自身分泌一些蛋白酶及蛋白酶抑制剂，使其寄生在人体的长期过程中与人体形成了相互作用的免疫机制，通过免疫隔离、分子模拟、破环抗体、免疫抑制、免疫调节等进行免疫逃避。近年来，以绦虫的基因组数据库和蛋白质数据库为研究对象，从猪带绦虫中鉴别出199个蛋白酶和35个蛋白酶抑制剂，这些蛋白酶分别属于金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶五大蛋白超家族，蛋白酶抑制剂分别属于丝氨酸蛋白酶抑制剂、半胱氨酸蛋白酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂、天冬氨酸蛋白酶抑制剂四大家族，其中丝氨酸蛋白酶抑制剂和半胱氨酸蛋白酶抑制剂是两种猪带绦虫分泌的主要蛋白酶抑制剂。其中丝氨酸蛋白酶抑制剂包括可逆的kunitz抑制剂家族及可逆的Kazal抑制剂家族、不可逆的MEROPS抑制剂家族。丝氨酸蛋白酶抑制剂的三级结构高度保守，包含9个α螺旋和3个β折叠，分为基序、螺旋状反应位点(RSL)和信号序列三部分，其中RSL主要包括P1和P1′两个活性位点。结构决定功能，丝氨酸蛋白酶抑制剂参与一些基本的生物学反应，发挥了其重要的作用生物学作用，比如免疫应答、抗凝作用、抗肿瘤作用、纤维蛋白的溶解作用、炎症反应、信号传导的级联放大反应和荷尔蒙的信号传导等，但是在免疫应答方面的作用机制和应用价值没有系统和深入的研究，仍需进一步的研究。补体是一组不耐热，可介导免疫和炎症反应的无活性的蛋白酶原。补体存在于人和动物的血清和组织液中。目前已经发现补体是由50多种补体固有成分，补体受体成分及补体调节蛋白组成的复杂生物反应系统，又称补体系统。补体系统构成了固有免疫和适应性免疫之间的桥梁。正常生理状态下，补体活化及其活化产生的产物可介导抗感染、细胞吞噬、细胞溶解、炎症介质作用等基本的生物学作用。但是，在病理情况下，补体系统成分的缺陷或者异常激活可引发多种疾病，包括系统性红斑狼疮(SLE)、白细胞黏附缺陷症、遗传性血管神经性水肿、类风湿性关节炎、肾脏疾病、缺血-再关注损伤等。因此，近年来，随着对补体系统的深入研究及生物技术的快速发展，抗补体药物的寻找及开发成为人们关注的焦点。但是，目前还没有开发出较好的抗补体制剂。化学合成的抗补体制剂成本高，工艺复杂，并且效果不佳，长期使用产生多种副作用，寻找天然的抗补体活性药物已经引起国内外学者广泛的关注。截止目前，国内对天然化合物类补体抑制剂的研究主要局限于对肝素以及麻黄等少量植物和微生物培养的研究，对其他类型的补体抑制剂的研究较少，基本处于空白状态，而国外对补体抑制剂已进行了广泛的研究，发现了多种类型的天然抗补体制剂，包括多糖类化合物、黄酮类化合物、甾体类化合物、皂苷类化合物、酶及多肽类化合物等多种天然化合物。研究表明，临床上广泛使用的免疫抑制剂药物如糖皮质激素、环孢素、大环内酯类抗生素等虽然对某些与补体过度激活相关的疾病有一定治疗作用，但由于该类药并非专一的补体抑制剂，特异性差，难以口服，长期使用会降低机体的免疫抑制力，导致抗感染能力下降，容易继发感染和使潜在病灶扩散，并产生多种并发症和副作用。天然产物来源的抗补体活性成分开发成本低，专一性强，因此，寻找天然来源的高度有效的补体调控分子具有十分重要的意义。
技术实现思路
基于上述现有技术存在的缺陷，本专利技术用分子生物学技术研究绦虫基因组学，从绦虫蛋白质数据库中筛选出猪肉绦虫TSM系列多肽，并设计引物，克隆及表达纯化蛋白，通过抗补体经典途径中绵羊红细胞溶血的抑制率实验研究猪肉绦虫TSM系列多肽的功能。本专利技术证实了多肽TSM1能对抗补体、抑制补体经典途径的溶血。TSM1多肽由63个氨基酸组成，编码该蛋白的基因全长189bp，该蛋白的理论分子量9820Da，有3对二硫键，包含1个Kunitz结构域，理化性质稳定，有望成为补体的天然抑制剂，为抗补体天然药物研发提供了新的先导分子。本专利技术目的通过以下技术方案来实现：本专利技术提供了一种多肽TSM1，所述多肽包含SEOIDNO.1所示氨基酸序列。本专利技术提供了一种分离的核酸分子，所述核酸分子编码多肽TSM1。进一步的，所述核酸分子包含SEOIDNO.2所示核苷酸序列。本专利技术提供了一种载体，所述载体包含编码多肽TSM1的核酸分子。本专利技术提供了一种细菌，所述细菌包含多肽TSM1或编码多肽TSM1的核酸分子。本专利技术提供了一组引物，所述引物组包含3对引物，分别为：SEOIDNO.5所示的TSM1-3FP1和SEOIDNO.6所示的TSM1-4RP1；SEOIDNO.4所示的TSM1-2FP2和SEOIDNO.7所示的TSM1-5RP2；SEOIDNO.3所示的TSM1-1FP3和SEOIDNO.8所示的TSM1-6RP3。进一步的，本专利技术还提供了上述引物在扩增多肽TSM1的编码核酸分子中的用途。本专利技术提供了一种多肽TSM1，和/或编码多肽TSM1的核酸分子在制备抗补体制剂中的用途。所述制剂为试剂盒、药物或药物组合物，优选药物或药物组合物。本专利技术的有益效果是：多肽TSM1能与体系中的补体结合发挥作用，补体系统是TSM1多肽的作用靶点，本专利技术为寻找补体对抗靶点及抗补体天然药物奠定基础，为抗补体天然药物研发提供了新的先导分子，TSM1有望成为在经典途径中抗补体的天然新药，具有重要的抗补体药物开发应用价值。附图说明图1.原核表达体系pET-28a(+)质粒图谱。图2.TSM1在NCBI中Blast结果分析。图3.TSM1目的序列的PCR产物电泳图：泳道M是DNAMarker条带，泳道1是TSM1的基因PCR产物条带。图4.pET-28a-TSM1重组质粒菌落PCR电泳图：泳道M是DNAMarker条带，泳道1，2，3，4，5是TSM1重组质粒菌落PCR产物条带。图5.TSM1重组蛋白高效液相色谱图。图6.经典途径的不同稀释度的豚鼠血清(补体)的效价(％，Mean±SD)。图7.TSM1经典途径抗补体活性的浓度依赖性验证。图8.猪肉绦虫TSM1多肽对补体浓度依赖的实验验证。具体实施方式通过以下实施例对本专利技术作进一步的详细描述，但应理解本专利技术并不受以下内容所限制。实施例1：结构蛋白序列分析1、利用生物信息学方法，通过互联网在三大核酸数据库里进行检索得到绦虫多肽序列，将得到的序列编号。2、利用http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP网站对序列分析去除信号肽序列。3、根据kunitz模式氨基酸序列6个半胱氨酸呈规律排布。XXXXXXXCXXXXXXXXCXXXXXXXXXXXXXXXCXXXXXXXCXXXXXXXXXXXXCXXXCXXXXX可以从序列中筛选出具有此结构的序列，分析比对，最后得到TSM系列多肽的序列，并且可能具有抗补体功能的序列。4、TSM1多肽的氨基酸序列：KMSYINRCNLPISSGQCRGYFLRYGYDSEADECRRFVYSGCRGNRNNFFTYNE本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种多肽TSM1，其特征在于，所述多肽包含SEO ID NO.1所示氨基酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种多肽TSM1，其特征在于，所述多肽包含SEOIDNO.1所示氨基酸序列。2.一种分离的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1所述多肽TSM1。3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包含SEOIDNO.2所示核苷酸序列。4.一种载体，其特征在于，所述载体包含权利要求2或3所述核酸分子。5.一种非人细胞，其特征在于，所述细胞包含权利要求1所述多肽、权利要求2或3所述核酸分子、或权利要求4所述载体。6.一组引物，其特征在于，引物组包含3对引物，分别为：SEOID...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈宗运，丁莉，罗旭东，刘田利，胡芳芳，
申请(专利权)人：湖北医药学院，
类型：发明
国别省市：湖北,42