肽激酶抑制剂及其使用方法技术

本文描述了蛋白质激酶C的分离调节肽、其嵌合肽及它们的变体。还描述了所述肽在用于治疗细胞增殖病状的组合物和方法中的用途。

Peptide kinase inhibitors and their application

In this paper, the separation and regulation peptide, chimeric peptide and their variants of protein kinase C are described. The use of the peptide in compositions and methods for treating cell proliferation disorders is also described.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】肽激酶抑制剂及其使用方法相关申请的交叉引用要求于2017年2月19日提交的美国临时专利申请号62/460,810的权益，其内容通过引用整体并入本文。
本公开涉及uORF的蛋白质激酶C的分离调节肽、其嵌合肽以及它们的变体。还描述了所述肽在用于治疗细胞增殖病状的组合物和方法中的用途。
技术介绍
翻译调节元件在细胞中起作用以响应于内部或外部刺激而快速改变蛋白质表达景图(landscape)。在这些元件中是位于mRNA5'的非翻译区的上游开放阅读框(uORF)。生物信息学研究表明，在约40％的人类mRNA中存在uORF。uORF通常与蛋白质表达水平降低相关，因为它们会降低下游ORF的翻译起始的效率。先前，我们报道了蛋白质激酶C异形体PKCeta的表达是经由两个uORF调节的，并示出了它们被翻译成短肽的潜力。蛋白质激酶，包括各种PKC异形体，被公认为它们在上万生物学过程中起调节作用，并且异常的PKC表达被理解成是包括那些涉及细胞增殖的因素在内的若干病状中的一个因素。因此，持续存在调节PKC表达的需要。
技术实现思路
本文描述了分离的和合成的、源自PKCeta异形体的uORF的肽，并且特别地，分离多肽包括与SEQIDNO:32所示氨基酸序列具有至少70％同一性的氨基酸序列。本文另外描述了SEQIDNO:32的分离多肽，其中，在位置10处的氨基酸是丙氨酸，如本文SEQIDNO:5所示。另外，本文描述了SEQIDNO:32的分离多肽，其中，在位置10处的氨基酸是半胱氨酸，如本文SEQIDNO:1所示。本文另外描述了如本文SEQIDNo:1-9所示的合成肽的组合，以及用于治疗异常细胞增殖(例如癌症)的化学治疗剂，诸如治疗方法中的和在制备用于治疗癌症的药物中使用的化学治疗剂。此外，本文描述了源自PKCzeta异形体的uORF的分离的、合成的和嵌合的肽，并且特别地分离多肽包括与SEQIDNO:11所示的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列。还提供了编码所述肽的核酸。本文另外描述了包括所述肽和/或编码肽的核酸的组合物，其用于治疗与异常细胞增殖有关的疾病或病症，包括用于制备治疗所述疾病或病症的药物。还提供了在与异常细胞增殖有关的疾病或病症的治疗中使用所述肽和/或核酸的方法。通过以下参考附图进行的详细描述，前述和其他目的、特征和优点将变得更加明显。附图说明图1A至图1C是人PKCη(PKCeta)的mRNA、其两个uORF和假底物(PS)序列以及它们与其他物种的其他PKC的同源性的示意性表示。图1A：PKCη的氨基酸序列uORF2(SEQIDNO:1)和假底物(PS)序列(SEQIDNO:19)用单字母代码表示。图1B：uORF2的氨基酸序列显示出高度保守性。将由人uORF2编码的氨基酸序列(SEQIDNO:1)与由其他哺乳动物物种(SEQIDNO:20-24，分别为恒河猴、大象、犬和大鼠)中的同源PKCη编码的uORF进行了比对。图1C：将PKCη(ηPS)的假底物的氨基酸序列(SEQIDNO:19)与所有其他人PKC的PS序列(SEQIDNO:25-31，分别为PKCα、PKCβ、PKCγ、PKCδ、PKCε、PKCζ和PKCλ/ι)以及与由uORF2编码的序列(SEQIDNO:3)进行了比对。所有序列均以单字母代码表示；经由HHpred工具包进行了多序列比对。图2A至图2D示出了源自PKCη的肽的示意性表示，并表明了uORF2编码的肽(uPEP21-26)抑制PKC激酶活性的能力。图2A是源自PKCη并且在本文描述的实施例中使用的肽的示意图。uPEP1-26指由uORF2编码的完整肽；uPEP9-26和uPEP18-26指缺少PS基序的对照肽；ηPS指包含PKCη的内部PS结构域的肽。图2B示出了测试不同肽对PKCη的激酶活性的影响的结果。使用髓磷脂碱性蛋白(p-MBP)作为底物以及γ-32P放射性激酶测定法测量了PKCη的激酶活性。将所有值均归一化为不含肽的对照样品(Cont.)。示出的数据是三个单独实验的平均值，并且也正如图2C中以凝胶形式所表示的。图2D：如在图2B中描述的进行了激酶测定法，描绘了使用2μM浓度的uPEP1-26。所有值均归一化为对照样品(不含肽)。示出的数据是三个单独实验的平均值。图3A至图3D表明了由uORF2编码的肽(uPEP21-26)的抑制乳腺癌细胞的细胞迁移的能力。图3A是从对MDA-MB-231细胞进行的划痕测定中拍摄的照片。将细胞接种在24孔板中，并与指定肽一起在无血清培养基中孵育4小时。4小时后，用200μl移液器尖端进行划痕。在指定的时间点拍摄每个划痕的选定区域的照片。通过ImageJ软件进行面积测量。图3B至图3D是表示如图4A中所述的分别对细胞系MDA-MB-231、MCF-7和MCF10A进行的划痕测定的分析的图。将所有值均归一化为每个孔的0时刻，并以百分比表示。图4A至图4D示出了由uORF2编码的肽(uPEP21-26)降低乳腺癌细胞和成胶质细胞瘤细胞的存活率的能力。图4A：将MCF-7细胞接种到48孔板上。24小时后，细胞与指定肽一起孵育了24小时)。孵育后，从每个孔中轻轻吸出带有被测肽的培养基，并将25μL的PrestoBlue试剂添加到48孔板的每个孔中，并根据建议在37℃在5％CO2中孵育15min。通过“InfiniteM200PRO”读取器检测了吸光度。图4B至图4D是与由图4A所述的相同的实验结果，但是分别在细胞系U251MG(成胶质细胞瘤细胞系)、MDA-MB-231和MCF10A上进行的。图5示出了由uORF2编码的肽(uPEP21-26)与依托泊苷的组合引起的对细胞死亡诱导的协同作用。将MCF-7细胞接种在96孔板中24小时。加入指定肽(5μM)，持续4小时。然后，将依托泊苷(50μM)加入孔中，持续48小时。根据制造商的说明，使用XTT试剂盒(BiologicalIndustries,Israel)分析了该板。图6A至图6C示出了uORF2编码的在位置10处突变的肽(uPEP1-26[c/a])在降低各种细胞系上的细胞存活率方面的效力。图6A：将MCF-7细胞接种在96孔板中，并与指定肽一起孵育了24小时。24小时后，根据制造商的说明，使用XTT试剂盒(BiologicalIndustries，Israel)监测了增殖速率。图6B：如图6A所示测试了MDA-MB-231细胞系。图6C：如图6A所示测试了HeLa细胞。)图7A至图7B示出了PKCη-敲除降低了乳腺4T1小鼠模型中的肿瘤侵袭性和转移形成。图7A：将表达sh-PKCη(SEQIDNO:33)的4T1细胞或加扰对照注射入8周龄雌性BALB/c小鼠的乳腺脂肪垫中。每周用游标卡尺测量了肿瘤直径。图7B：8周后处死小鼠，并使用布恩氏溶液(Bouin'ssolution)计数了在肺中形成的转移数。误差棒表示平均值±标准误差(s.e.m)，统计分析表明两尾未配对样品t检验统计显著性本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种分离多肽，包含示为SEQ ID NO:32的氨基酸序列。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170219 US 62/460,8101.一种分离多肽，包含示为SEQIDNO:32的氨基酸序列。


2.根据权利要求1所述的分离多肽，其中，在位置10处的氨基酸是丙氨酸，如本文SEQIDNO:5所示。


3.根据权利要求1所述的分离多肽，其中，在位置10处的氨基酸是半胱氨酸，如本文SEQIDNO:1所示。


4.一种分离多肽，包含与序列SEQIDNO:1或5具有至少70％同一性的氨基酸序列。


5.一种分离多肽，包含与本文SEQIDNO:11所示的氨基酸序列具有至少70％同一性的氨基酸序列。


6.根据权利要求1-5中任一项所述的分离多肽，其中，所述氨基酸序列包含肉豆蔻酰基。


7.根据权利要求1-6中任一项所述的分离多肽，进一步包含至少一种细胞穿透肽(CPP)。


8.根据权利要求7所述的分离多肽，其中，所述细胞穿透肽是穿透肽。


9.根据权利要求7或权利要求8所述的分离多肽，其中，所述氨基酸序列是SEQIDNO:2所示的序列。


10.根据权利要求1所述的分离多肽，其中，所述氨基酸序列与SEQIDNO:19所示的氨基酸序列具有至少70％同一性。


11.一种分离核酸，包含编码权利要求1-10中任一项所述的分离多肽的核酸序列。


12.一种表达载体，包含权利要求11所述的分离核酸。


13.一种药物组合物，包含权利要求1-10中任一项所述的分离多肽和药学上可接受的载体或赋形剂。

【专利技术属性】
技术研发人员：埃塔·利夫内，西加尔·弗罗斯特，埃斯蒂·耶格洛坦，伊兰·斯莫利，阿萨夫·本阿里，
申请(专利权)人：国家生物技术研究所公司，本古里安大学BG内盖夫技术和应用公司，
类型：发明
国别省市：以色列;IL