调节SIGLEC依赖性免疫反应的多肽制造技术

本发明专利技术涉及糖基化多肽，其包含与哺乳动物蛋白优选人蛋白的至少一个片段相同或同源的氨基酸序列，其中所述糖基化多肽含有一个或多个唾液酸化的O‑聚糖，并且其中与所述哺乳动物蛋白或其片段相比，所述糖基化多肽对选自SIG‑5、SIG‑7、SIG‑8和SIG‑9的一种或多种SIGLEC显示出增加的结合亲和力。本发明专利技术进一步涉及包含第一多肽和第二多肽的组合物，其中所述第一多肽是含有一个或多个唾液酸化的O‑聚糖的糖基化多肽，所述第二多肽含有与第二哺乳动物蛋白特别是人蛋白同源或相同的氨基酸序列，其中与所述第二多肽相比，所述组合物对选自一种或多种SIGLEC的SIGLEC具有增加的结合亲和力，所述一种或多种SIGLEC选自SIG‑5、SIG‑7、SIG‑8和SIG‑9。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】调节SIGLEC依赖性免疫反应的多肽
本专利技术涉及基于哺乳动物蛋白的糖基化多肽以及使用所述糖基化多肽的治疗方法，所述糖基化多肽由于调节的SIGLEC结合而表现出降低的免疫反应或增强的免疫耐受性。本专利技术进一步涉及蛋白复合物以及使用所述蛋白复合物的治疗方法，所述蛋白复合物由于调节的SIGLEC结合而表现出降低的免疫反应或增强的免疫耐受性。
技术介绍
血友病是一组遗传性基因疾病，其会损害身体控制血液凝固或凝血的能力。在其最常见的形式血友病A中，缺乏凝血因子VIII(FVIII)，血友病A在5000至10000个男婴中出现约1例。FVIII蛋白是血液凝固中必需的辅助因子，具有多功能特性。可以用源自血浆的FVIII浓缩物或用重组产生的FVIII治疗FVIII缺乏。用FVIII浓缩物治疗使血友病患者具有正常的生活。在历史上，已经用源自人血浆的FVIII治疗血友病A。在血浆中，在正常条件下，FVIII分子总是与其辅因子结合；血管性血友病因子(vWF)，其稳定FVIII分子使其免于不同形式的衰减。已经描述了许多方法用于从血浆或培养物中纯化VIII因子，这些方法在存在或不存在血管性血友病因子(vonWillebrandfactor)的情况下重组产生VIII因子(rFVIII)。在90年代，最早的重组FVIII(rFVIII)产品上市销售，产品分为模拟血浆中FVIII的主要形式的全长rFVIII分子；以及B结构域缺失的rFVIII分子(Eriksson等，2001)，其中一个非活性部分(B结构域)已被除去，这两种产品都具有高纯度(均不含vWF)。血友病A患者根据需要用FVIII治疗或用FVIII作为预防性治疗每周数次施用。对于预防性治疗，以15-25IU/kg体重每周三次施用FVIII是必要的，这是因为对FVIII的持续需要以及FVIII在血液系统中的短半衰期，半衰期在人类中为仅约11小时。(Ewenstein等，2004)。在常见的情形中，外源性施用FVIII的持续治疗引起患者免疫系统的反应(Saenko等，Haemophilia8：1-11(2002))，这对治疗产生了严重的限制。目前，为了在具有血友病A(先天性FVIII缺乏症)和抑制物的患者中实现免疫耐受的最常见的选择是免疫耐受诱导(ITI)，其中长时间施用高剂量的FVIII。然而，该治疗需耗费长达两年的时间，在约30％的患者中仍然是不成功的，非常昂贵并且不能以预防性的方式来使用以抑制抑制性抗体的初始形成。因此，需要减弱免疫反应的方法。一种有前景的方法是对FVIII或其结合配偶体vWF的糖基化的优化。例如，WO2014/176125A1涉及用于诱导针对FVIII的抗原特异性免疫耐受的免疫缀合物。该免疫缀合物是与特定聚糖配体缀合的FVIII蛋白，其靶向在B细胞上表达的SIGLEC，即SIG-1或SIG-10(或直系同源物SIG-G)。特别地，该聚糖配体与引入有FVIII的脂质体偶联。唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素(SIGLEC)包括具有15个人细胞表面受体和9个鼠细胞表面受体的家族，所述表面受体在小鼠和人免疫系统中除大多数T细胞以外的各种白细胞上表达。SIGLEC位于不同的细胞类型上并与不同的聚糖结构结合(在Paulson等人，2012年中有论述)。例如，已证实vWF和FVIII与SIG-5的结合(Pegon2012)。然而，结合机制仍然未知。在WO2014/179184A1中描述了不同的方法。作者建议通过添加SIGLEC配体来减少不需要的抗体免疫反应并诱导凝血因子如FVIII的免疫耐受。SIGLEC配体选自9-N-联苯基羧基-NeuAca2-6Gal～l-4GlcNAc(6'—BPCNeuAc)、NeuAca2-6Galwl-4GlcNAc和NeuAca2-6Galwl-4(6-磺基)GlcNAc。SIGLEC配体通过水溶性聚合物与凝血因子连接。
技术实现思路
本专利技术尤其基于以下发现：在血浆来源的蛋白中天然存在的聚糖结构，特别是vWF，能够与一组SIGLEC相互作用，所述SIGLEC特别是SIG-5、SIG-7、SIG-8和SIG-9。此外，专利技术人发现通过蛋白上的聚糖结构的修饰，可以增加与SIGLEC如SIG-5、SIG-7、SIG-8和SIG-9的相互作用。这种增加导致施用该蛋白的患者的免疫反应减少和/或免疫耐受性增强。因此，根据第一方面，本专利技术提供糖基化多肽，其包含与哺乳动物蛋白优选人蛋白的至少一个片段相同或同源的氨基酸序列，其中所述糖基化多肽含有一个或多个唾液酸化的O-聚糖，并且其中与所述哺乳动物蛋白或其片段相比，所述多肽对选自SIG-5、SIG-7、SIG-8和SIG-9中的一种或多种SIGLEC具有增加的结合亲和力。专利技术人已经特别定义了一种聚糖结构，该聚糖结构一方面是与SIGLEC相互作用所需的，但是添加该聚糖结构还会导致与SIGLEC的结合增加。造成这一点的原因是唾液酸化的核心2O-聚糖和/或延伸核心1O-聚糖。因此，根据第一方面的糖基化多肽还可以定义为包含与哺乳动物蛋白优选人蛋白的至少一个片段相同或同源的氨基酸序列的糖基化多肽，其中所述糖基化多肽含有一个或多个唾液酸化的O-聚糖，并且其中所述糖基化多肽的唾液酸化的核心2O-聚糖和唾液酸化的延伸核心1O-聚糖的总数量高于所述哺乳动物蛋白或其片段的唾液酸化的核心2O-聚糖和唾液酸化的延伸核心1O-聚糖的总数量。具有含有唾液酸化的核心2O-聚糖和/或唾液酸化的延伸核心1O-聚糖(特别是唾液酸化的核心2O-聚糖)的聚糖组分的蛋白可以用于通过联合施用来改变患者对治疗性蛋白的免疫反应。因此，根据第二方面，本专利技术涉及糖基化多肽用于减少患者对治疗性蛋白的免疫反应或增强患者对治疗性蛋白的免疫耐受性的用途，所述糖基化多肽含有一个或多个唾液酸化的O-聚糖并显示出对选自SIG-5、SIG-7、SIG-8和SIG-9中的一种或多种SIGLEC的结合。利用对于具有SIGLEC结合亲和力的糖基化多肽的修饰，不仅可以直接改变经修饰的多肽本身的SIGLEC结合亲和力，而且还可以改变蛋白复合物或组合物的SIGLEC结合亲和力，其中所述糖基化多肽是例如VIII因子(FVIII)与血管性血友病因子(vWF)的复合物的一部分。因此，根据第三方面，本专利技术提供包含第一多肽和第二多肽的蛋白组合物，其中第一多肽是含有一个或多个唾液酸化的O-聚糖的糖基化多肽，第二多肽含有与第二哺乳动物蛋白特别是人蛋白同源或相同的氨基酸序列，其中与第二多肽相比，该组合物对选自SIG-5、SIG-7、SIG-8和SIG-9的一种或多种SIGLEC具有增加的结合亲和力。根据第三方面的组合物的第一多肽和第二多肽优选形成蛋白复合物。根据第四方面，本专利技术提供分离的多核苷酸，其包含编码根据本专利技术第一方面的糖基化多肽的核酸序列。在第五方面，本专利技术还涉及包含根据本专利技术第四方面的多核苷酸的表达载体。根据第一方面的糖基化多肽，特别是vWF或FVIII，以及根据第三方面的组合物，特别是FVIII与vWF的复合物，由于减少的免疫反应而特别适用于医学治疗。因此，根据第四方面，本专利技术提供根据第一方面定义的糖基化多肽或根据第三方面定义的组合物，其用于治疗或预防出血性疾病。附图说明图1显示了v本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种糖基化多肽，其包含与哺乳动物蛋白，优选人蛋白质，的至少一个片段相同或同源的氨基酸序列，其中所述糖基化多肽含有一个或多个唾液酸化的O‑聚糖，并且其中与所述哺乳动物蛋白或其片段相比，所述糖基化多肽对选自SIG‑5、SIG‑7、SIG‑8和SIG‑9的一种或多种SIGLEC显示出增加的结合亲和力。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.05.20 EP 16170690.81.一种糖基化多肽，其包含与哺乳动物蛋白，优选人蛋白质，的至少一个片段相同或同源的氨基酸序列，其中所述糖基化多肽含有一个或多个唾液酸化的O-聚糖，并且其中与所述哺乳动物蛋白或其片段相比，所述糖基化多肽对选自SIG-5、SIG-7、SIG-8和SIG-9的一种或多种SIGLEC显示出增加的结合亲和力。2.根据权利要求1所述的糖基化多肽，所述糖基化多肽对SIGLECSIG-5、SIG-7、SIG-8和SIG-9显示出增加的结合。3.根据权利要求1或2所述的糖基化多肽，其中所述糖基化多肽的唾液酸化的核心2O-聚糖和延伸核心1O-聚糖的总数量高于所述哺乳动物蛋白或其片段的唾液酸化的核心2O-聚糖和延伸核心1O-聚糖的数量。4.根据权利要求1或2所述的糖基化多肽，其中所述糖基化多肽的唾液酸化核心2O-聚糖的数量高于所述哺乳动物蛋白或其片段的唾液酸化的核心2O-聚糖的数量。5.根据前述权利要求中任一项所述的糖基化多肽，其中所述多肽含有一个或多个O-糖基化位点簇，其中一个簇包含至少两个O-糖基化位点，更优选至少三个O-糖基化位点，最优选至少四个O-糖基化位点。6.根据权利要求5所述的糖基化多肽，其中所述一个或多个簇在十个氨基酸中含有至少一个O-糖基化位点，优选在四个氨基酸中含有至少一个O-糖基化位点，更优选在三个氨基酸中含有至少一个O-糖基化位点，最优选在两个氨基酸中含有一个O-糖基化位点。7.根据权利要求5或6中任一项所述的糖基化多肽，其含有至少两个簇，更优选至少三个簇。8.根据权利要求5至7中任一项所述的糖基化多肽，其中所述簇被少于100个氨基酸，优选少于50个氨基酸，更优选少于30个氨基酸隔开。9.根据前述权利要求中任一项所述的糖基化多肽，其中所述唾液酸化的O-聚糖含有α2-3连接的和/或α2-8糖苷键连接的至少两个唾液酸，更优选至少三个唾液酸。10.根据权利要求9所述的糖基化多肽，其中基于所述唾液酸化的O-聚糖的数量，核心2O-聚糖的百分比为至少5％，更优选至少10％，更优选至少35％，最优选至少50％。11.根据前述权利要求中任一项所述的糖基化蛋白，其还包含多聚化结构域。12.根据前述权利要求中任一项所述的糖基化多肽，其中所述人蛋白选自vWF、FVIII、FVII、FIX、ADAMTS13。13.根据权利要求12所述的糖基化多肽，其中人蛋白或其片段是FVIII蛋白，特别是全长FVIII、B结构域缺失的FVIII或其中B结构域的一部分已被间隔肽替换的FVIII蛋白。14.根据权利要求3至13中任一项所述的糖基化多肽，其中一个或多个O-糖基化位点位于与所述哺乳动物蛋白或其片段同源或相同的所述氨基酸序列内，特别是替换所述哺乳动物蛋白或其片段的氨基酸。15.根据权利要求3至13中任一项所述的糖基化多肽，其中所述糖基化多肽是融合蛋白，其中含有一个或多个O-糖基化位点的第二氨基酸序列共价连接至与所述人蛋白或其片段相同或同源的所述氨基酸序列。16.根据权利要求15所述的糖基化多肽，其中共价接头选自肽键、化学接头或糖苷键。17.根据权利要求15或16所述的糖基化多肽，其中所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：克里斯托夫·坎尼希特，斯特凡·温厄，吉多·科拉，巴巴拉·索尔卡维图尔斯卡，
申请(专利权)人：瑞士奥克特珐玛公司，
类型：发明
国别省市：瑞士,CH