嵌合神经毒素制造技术

本发明专利技术涉及具有增强特性的嵌合神经毒素及其在治疗中的用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】嵌合神经毒素专利
本专利技术涉及具有增强特性的嵌合神经毒素及其在治疗中的用途。背景梭状芽孢杆菌(Clostridia)属细菌产生高度有效且特异性的蛋白质毒素，其可以毒害神经元和它们被递送到的其他细胞。此类梭菌毒素的实例包括由破伤风梭菌(TeNT)和肉毒梭菌(BoNT)血清型A-G产生的神经毒素，以及由巴氏梭菌(C.baratii)和丁酸梭菌(C.butyricum)产生的神经毒素。梭菌神经毒素中已知有一些最有效的毒素。举例来说，取决于血清型，肉毒杆菌神经毒素对于小鼠的半数致死剂量(LD50)值为0.5至5ng/kg。破伤风和肉毒杆菌毒素都通过抑制受影响的神经元的功能，特别是神经递质的释放起作用。虽然肉毒杆菌毒素作用于神经肌肉接点并抑制外周神经系统中的胆碱能传递，但破伤风毒素在中枢神经系统中起作用。在自然界中，梭菌神经毒素被合成为单链多肽，其被蛋白水解切割事件翻译后修饰以形成通过二硫键连接在一起的两条多肽链。切割发生在特定的切割位点，该位点通常称为位于提供链间二硫键的半胱氨酸残基之间的激活位点。正是这种双链形式是毒素的活性形式。这两条链被称为重链(H链)，其具有约100kDa的分子量，和轻链(L链)，其具有约50kDa的分子量。H链包含N-端易位组分(HN结构域)和C-端靶向组分(HC结构域)。切割位点位于L-链和易位结构域组分之间。在HC结构域与其靶神经元结合并通过内体将结合的毒素内化入细胞后，HN结构域将L链易位穿过内体膜并进入胞质溶胶，并且L-链提供蛋白酶功能(也称为非细胞毒性蛋白酶)。非细胞毒性蛋白酶通过蛋白水解切割称为SNARE蛋白的细胞内转运蛋白(例如SNAP-25、VAMP或Syntaxin)来起作用-参见GeraldK(2002)“CellandMolecularBiology”(第4版)JohnWiley&Sons，Inc。首字母缩写词SNARE来源于术语SolubleNSFAttachmentReceptor，其中NSF是指N-乙基马来酰亚胺敏感因子(N-Ethylmaleimide-SensitiveFactor)。SNARE蛋白与细胞内囊泡融合所必需的，因此是通过囊泡转运从细胞中分泌分子所必需的。蛋白酶功能是锌依赖性内肽酶活性并且对SNARE蛋白表现出高底物特异性。因此，一旦递送至期望的靶细胞，非细胞毒性蛋白酶能够抑制来自靶细胞的细胞分泌。梭菌神经毒素的L链蛋白酶是切割SNARE蛋白的非细胞毒性蛋白酶。鉴于SNARE蛋白质的普遍性质，梭菌神经毒素如肉毒杆菌毒素已成功用于各种疗法中。举例来说，我们提及WilliamJ.Lipham,CosmeticandClinicalApplicationsofBotulinumToxin(Slack,Inc.,2004)，其描述了使用梭菌神经毒素如肉毒杆菌神经毒素(BoNT)，BoNT/A，BoNT/B，BoNT/C1，BoNT/D，BoNT/E，BoNT/F和BoNT/G以及破伤风神经毒素(TeNT)，以在许多治疗和化妆或美容应用中抑制神经元传导-例如市售肉毒杆菌毒素产品目前被批准为用于适应证的治疗，所述适应证包括局灶性痉挛状态、上肢痉挛状态、下肢痉挛状态、颈部张力障碍、眼睑痉挛、半面痉挛、腋部多汗症、慢性偏头痛、神经性逼尿肌过度活动、眉间纹和严重外眦线。另外，描述了梭菌神经毒素疗法用于治疗神经肌肉病症(参见US6,872,397)；用于治疗子宫病症(参见US2004/0175399)；用于治疗溃疡和胃食管反流疾病(参见US2004/0086531)；用于治疗张力障碍(参见US6,319,505)；用于治疗眼睛病症(参见US2004/0234532)；用于治疗眼睑痉挛(参见US2004/0151740)；用于治疗斜视(参见US2004/0126396)；用于治疗疼痛(参见US6,869,610，US6,641,820，US6,464,986和US6,113,915)；用于治疗纤维肌痛(参见US6,623,742，US2004/0062776)；用于治疗腰痛(参见US2004/0037852)；用于治疗肌肉损伤(参见US6,423,319)；用于治疗窦性头痛(参见US6,838,434)；用于治疗紧张性头痛(参见US6,776,992)；用于治疗头痛(参见US6,458,365)；用于减轻偏头痛性头痛(参见US5,714,469)；用于治疗心血管疾病(参见US6,767,544)；用于治疗神经障碍例如帕金森病(参见US6,620,415，US6,306,403)；用于治疗神经精神障碍(参见US2004/0180061，US2003/0211121)；用于治疗内分泌失调(参见US6,827,931)；用于治疗甲状腺病症(参见US6,740,321)；用于治疗受胆碱能影响的汗腺病症(参见US6,683,049)；用于治疗糖尿病(参见US6,337,075，US6,416,765)；用于治疗胰腺病症(参见US6,261,572，US6,143,306)；用于治疗癌症例如骨肿瘤(参见US6,565,870，US6,368,605，US6,139,845，US2005/0031648)；用于治疗耳部病症(参见US6,358,926，US6,265,379)；用于治疗自主神经障碍如胃肠肌肉障碍和其他平滑肌功能障碍(参见US5,437,291)；用于治疗与皮肤细胞增殖性病症相关的皮肤损伤(参见US5,670,484)；用于治疗神经源性炎性病症(参见US6,063,768)；用于减少脱发和刺激毛发生长(参见US6,299,893)；用于治疗下行口(参见US6,358,917)；用于减少食欲(参见US2004/40253274)；用于牙科治疗和程序(参见US2004/0115139)；用于治疗神经肌肉障碍和病症(参见US2002/0010138)；用于治疗各种病症和状况以及相关的疼痛(参见US2004/0013692)；用于治疗由粘液高分泌导致的病症，如哮喘和COPD(参见WO00/10598)；和用于治疗非神经元病症如炎症，内分泌疾病，外分泌疾病，免疫病症，心血管疾病，骨骼病症(参见WO01/21213)。所有上述出版物均通过引用整体并入本文。预计非细胞毒性蛋白酶如梭菌神经毒素(例如BoNT和TeNT)在人类和其他哺乳动物的治疗和美容治疗中的应用将扩大到可受益于这些毒素的性质的不断扩大的疾病和病痛范围。目前，所有批准的包含BoNT的药物/化妆品制剂含有从梭菌菌株中纯化的天然存在的神经毒素(在或的情况下为BoNT/A，在的情况下为BoNT/B)。重组技术通过引入对神经毒素序列和/或结构的修饰，提供了改变或优化其性质的可能性。特别地，已经产生了嵌合神经毒素，其中HC结构域或HCC亚结构域被来自不同神经毒素的HC结构域或HCC亚结构域替代。Rummel等人，2011(ExchangeoftheHCCdomainmediatingdoublereceptorrecognitionimprovesthepharmacodynamicpropertiesofbotulinumneurotoxin.FEBSJournal,278(23),4506-45本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种嵌合神经毒素，包含来自第一神经毒素的LHN结构域，所述LHN结构域与来自第二神经毒素的HC结构域共价连接，其中所述第一神经毒素和第二神经毒素是不同的，其中所述LHN结构域的C‑末端氨基酸残基对应于分离所述第一神经毒素中LHN和HC结构域的310螺旋的第一氨基酸残基，和其中所述HC结构域的N‑末端氨基酸残基对应于分离所述第二神经毒素中的LHN和HC结构域的310螺旋的第二氨基酸残基。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.05.05 GB 1607901.41.一种嵌合神经毒素，包含来自第一神经毒素的LHN结构域，所述LHN结构域与来自第二神经毒素的HC结构域共价连接，其中所述第一神经毒素和第二神经毒素是不同的，其中所述LHN结构域的C-末端氨基酸残基对应于分离所述第一神经毒素中LHN和HC结构域的310螺旋的第一氨基酸残基，和其中所述HC结构域的N-末端氨基酸残基对应于分离所述第二神经毒素中的LHN和HC结构域的310螺旋的第二氨基酸残基。2.根据权利要求1的嵌合神经毒素，其中所述第一神经毒素是肉毒杆菌神经毒素(BoNT)血清型A，血清型B，血清型C，血清型D，血清型E，血清型F或血清型G或破伤风神经毒素(TeNT)，和其中所述第二神经毒素是肉毒杆菌神经毒素(BoNT)血清型A，血清型B，血清型C，血清型D，血清型E，血清型F或血清型G或破伤风神经毒素(TeNT)。3.根据权利要求1或2的嵌合神经毒素，其中所述来自第一神经毒素的LHN结构域对应于：-BoNT/A1的氨基酸残基1至872，-BoNT/B1的氨基酸残基1至859，-BoNT/C1的氨基酸残基1至867，-BoNT/D的氨基酸残基1至863，-BoNT/E1的氨基酸残基1至846，-BoNT/F1的氨基酸残基1至865，-BoNT/G的氨基酸残基1至864，或-TeNT的氨基酸残基1至880，其中所述来自第二神经毒素的HC结构域对应于：-BoNT/A1的氨基酸残基873至1296，-BoNT/B1的氨基酸残基860至1291，-BoNT/C1的氨基酸残基868至1291，-BoNT/D的氨基酸残基864至1276，-BoNT/E1的氨基酸残基847至1251，-BoNT/F1的氨基酸残基866至1275，-BoNT/G的氨基酸残基865至1297，或-TeNT的氨基酸残基881至1315。4.根据权利要求1，2或3的嵌合神经毒素，其中所述第一神经毒素是BoNT/A，并且其中所述第二神经毒素是BoNT/B。5.根据权利要求4的嵌合神经毒素，其中所述第一神经毒素是BoNT/A1，并且其中所述第二神经毒素是BoNT/B1。6.根据权利要求5的嵌合神经毒素，其中所述来自第一神经毒素的LHN结构域对应于BoNT/A1的氨基酸残基1至872，并且其中所述来自第二神经毒素的HC结构域对应于BoNT/B1的氨基酸残基860至1291。7.根据权利要求4，5或6的嵌合神经毒素，其中所述来自BoNT/B神经毒素的HC结构域在HCC亚结构域中包含至少一个氨基酸残基取代、添加或缺失，其与天然BoNT/B序列相比，具有增加BoNT/B神经毒素对人类SytII受体的结合亲和力的作用。8.根据权利要求7的嵌合神经毒素，其中所述HCC亚结构域中的所述至少一个氨基酸残基取代、添加或缺失包含选自以下组成的组的取代突变：V1118M；Y1183M；E1191M；E1191I；E1191Q；E1191T；S1199Y；S1199F；S1199L；S1201V；E1191C，E1191V，E1191L，E1191Y...

【专利技术属性】
技术研发人员：S·M·刘，
申请(专利权)人：益普生生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：英国,GB