用于连接DNA结合结构域和切割结构域的组合物制造技术

本文公开用于连接DNA结合结构域和切割结构域(或切割半结构域)以形成具有替代性构型的非天然存在的核酸酶的组合物。还描述了制备和使用包含这些接头的组合物的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于连接DNA结合结构域和切割结构域的组合物相关申请的交叉引用本申请要求2016年2月2日提交的美国临时申请号62/290,065的权益，所述临时申请的公开内容以引用方式整体并入本文。在联邦资助的研究下进行的专利技术的权利声明不适用。
本公开涉及基因组和蛋白质工程领域。
技术介绍
包含可操作地连接至切割结构域的DNA结合结构域(核苷酸或多肽)的人工核酸酶，诸如工程化锌指核酸酶(ZFN)、转录活化因子样效应物核酸酶(TALEN)、具有工程化crRNA/tracrRNA('单指导RNA')的CRISPR/Cas系统和/或基于Argonaute系统的核酸酶(例如，来自嗜热栖热菌(T.thermophilus)，被称为'TtAgo’(Swarts等(2014)Nature507(7491):258-261)，已用于基因组序列的靶向改变。例如，核酸酶已用于插入外源序列，使一种或多种内源基因失活，产生基因表达模式改变的生物体(例如作物)和细胞系等等。参见，例如9,255,250；9,045,763；9,005,973；8,956,828；8,945,868；8,703,489；8,586,526；6,534,261；6,599,692；6,503,717；6,689,558；7,067,317；7,262,054；7,888,121；7,972,854；7,914,796；7,951,925；8,110,379；8,409,861；美国专利公布20030232410；20050208489；20050026157；20050064474；20060063231；20080159996；201000218264；20120017290；20110265198；20130137104；20130122591；20130177983和20130177960以及20150056705。例如，核酸酶对(例如，锌指核酸酶，TALEN)可用于切割基因组序列。所述对中的每个成员通常包括连接至核酸酶的一个或多个切割结构域(或半结构域)的工程化(非天然存在的)DNA结合蛋白。当DNA结合蛋白结合其靶位点时，结合那些DNA结合蛋白的切割结构域被定位成使得基因组的二聚化和随后切割可以发生，通常在锌指核酸酶对或TALEN对之间。已经显示，核酸酶对的切割活性与连接锌指和切割结构域的接头(“ZC”接头)长度、氨基酸组成和靶位点(结合位点)之间的距离(间隙)有关。参见，例如美国专利号9,394,531；8,772,453；7,888,121及8,409,861；Smith等(2000)NucleicAcidsRes.28:3361-3369；Bibikova等(2001)Mol.Cell.Biol.21:289-297；美国公布号20150064789。当使用核酸酶融合蛋白对时，已经在融合蛋白的结合位点相隔5或6个核苷酸(如从每个结合位点的近边所测量)定位时获得用当前可用的ZC接头和切割半结构域进行的最佳切割。参见，例如美国专利号7,888,121。美国专利公布20090305419和20150064789描述通过使用各种接头序列(用于各种间隙间隔)和/或修饰FokI切割结构域的N端残基来连接DNA结合结构域和切割结构域。然而，仍然需要允许靶向修饰的方法和组合物，其中人工核酸酶可在替代性架构中切割内源基因组序列，并且结合位点隔开为6、7、8个或更多个碱基对。
技术实现思路
本文公开了用于连接DNA结合结构域和切割结构域以形成核酸酶的组合物，所述核酸酶例如与常规接头(其使用尾对尾架构)相比具有相同或改变的靶位点构型(架构)和/或隔开(间隙)偏好的核酸酶，所述靶位点构型(架构)和/或隔开(间隙)偏好包括但不限于头对尾架构(其中二聚体的DNA结合结构域结合相同DNA链)、头对头架构(其中DNA结合结构域可操作地连接至切割结构域的N端)，以及对称和不对称的尾对尾架构。还描述了用于靶向切割DNA的包含这些接头的融合分子以及这些融合分子的二聚体。本公开还提供了使用这些融合分子及其组合物以靶向切割目标区域中的细胞染色质和/或在细胞中的预定目标区域进行同源重组的方法。因此，在一个方面，本文描述了用于将DNA结合结构域(例如，锌指蛋白、TAL效应物结构域或CRISPR/Cas核酸酶系统的单指导(sg)RNA)连接至功能结构域，诸如核酸酶(切割)结构域(例如，野生型或工程化FokI切割结构域)。接头用于将任何DNA结合结构域连接至功能结构域(例如，切割结构域)。在某些实施方案中，接头从蛋白质DNA结合结构域(ZFP或TALE)的N或C端延伸，或从多核苷酸DNA结合结构域(例如，sgRNA)的5’或3’端延伸。在某些实施方案中，氨基酸接头序列在蛋白质DNA结合结构域的N或C端的最后残基与切割结构域的N或C端的最后残基之间延伸。在其他实施方案中，氨基酸接头序列与多核苷酸DNA结合结构域(例如，sgRNA)的任何部分缔合。接头可具有任何长度，例如长度介于4与22之间个氨基酸，包括长度为8、9、10、11、12、13、14、15、16、17个或更多个残基。在其他实施方案中，接头包括图4、5、6、7、8、9、11或19中所示的任何接头(SEQIDNO:6-281)。在某些实施方案中，接头包括如图11或图19B中所示的接头。此外，接头可用于由5、6、7、8、9、10、11个或更多个碱基对隔开的成对靶位点。在另一些方面，本文描述了包含DNA结合结构域(例如，锌指蛋白、TALE、sgRNA)、功能结构域(例如，核酸酶切割结构域(例如，FokI、Cas核酸酶等)的融合分子，并且还包含如本文所述的在(连接)DNA结合结构域与功能结构域之间的接头。在某些实施方案中，融合分子包含DNA结合结构域、切割结构域以及DNA结合结构域与切割结构域之间的接头，其中接头包含如SEQIDNO:6-281中任一种所示的序列或由其组成。在某些实施方案中，接头包括如图11或图19B中所示的接头或由其组成。在某些实施方案中，融合分子包含DNA结合结构域(例如，ZFP或TALE)以及DNA结合结构域的N或C端的FokI切割结构域。在某些实施方案中，接头在DNA结合结构域的N端与切割结构域的C端之间延伸。核酸酶切割结构域可以任何方式来修饰，所述任何方式包括添加、缺失和/或取代一个或多个氨基酸残基。任何融合分子均可包含野生型或工程化切割结构域，包括但不限于具有对二聚化界面的一个或多个修饰的切割结构域，使得仅形成异源二聚体；和/或对催化结构域的一个或多个修饰，使得核酸酶为一种切口酶，因为其进行单链切割。在某些实施方案中，切割结构域可为切割半结构域。在另一方面，本文描述包含第一融合分子和第二融合分子的二聚体，所述第一融合分子包含如本文所述的接头，所述第二融合分子包含第二DNA结合结构域和第二野生型或工程化切割结构域。在某些实施方案中，至少一种融合分子包含如本文所述的接头。在其他实施方案中，两种融合分子均包含如本文所述的接头。在另一些实施方案中，二聚体靶序列(例如，在双链DNA中)的DNA结合结构域由5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16个(或更多个)碱基对，优选6至11个碱基对隔开。重要的是本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种融合分子，其包含DNA结合结构域、野生型或工程化切割结构域以及所述DNA结合结构域与所述切割结构域之间的氨基酸接头，其中所述接头包含如SEQ ID NO:6‑281中任一种所示的序列。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.02.02 US 62/290,0651.一种融合分子，其包含DNA结合结构域、野生型或工程化切割结构域以及所述DNA结合结构域与所述切割结构域之间的氨基酸接头，其中所述接头包含如SEQIDNO:6-281中任一种所示的序列。2.根据权利要求1所述的融合分子，其中所述DNA结合结构域包含锌指蛋白、TAL效应物结构域或单指导RNA(sgRNA)。3.根据权利要求1或权利要求2所述的融合分子，其中所述接头在所述DNA结合结构域的N端与所述切割结构域的C端之间延伸。4.一种二聚体，其包含根据权利要求1至3中任一项所述的第一融合分子以及包含第二DNA结合结构域和第二野生型或工程化切割结构域的第二融合分子。5.根据权利要求4所述的二聚体，其中所述第二融合分子还包含所述DNA结合结构域与所述切割结构域之间的接头，其中所述接头包含如SEQIDNO:6-281中任一种所示的序列。6.根据权利要求4或权利要求5所述的二聚体，其中所述DNA结合结构域结合双链靶DNA中的相对或相同的DNA链。7.据权利要求4至6中任一项所述的二聚体，其中所述二聚体在靶双链DNA中进行双链或单链切割。8.根据权利要求4至...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·C·米勒，D·帕斯乔恩，E·J·瑞巴，
申请(专利权)人：桑格摩生物治疗股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国,US