含受缺氧调控的人工转录因子的载体系统,其构建及应用技术方案

一种受缺氧调控的人工转录因子，其特征在于，它是由ＧＡＬ４　　ＤＮＡ结合结构域与ＨＩＦ１α转录激活结构域融合而成的。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
,其构建及应用的制作方法
本专利技术属于基因工程领域，涉及一种载体系统；进一步的，本专利技术涉及一种、其构建及应用。
技术介绍
现代医学研究发现，许多疾病的发生与缺氧及其引起的代谢异常和血管新生有关。因此，构建缺氧诱导的表达载体用于基因治疗是近年来的研究热点。在现有技术中，国内外研究者大多采用受缺氧诱导基因的顺式作用元件HRE调控下游基因的表达，研究其对缺血性疾病和肿瘤的治疗作用，取得了很好的诱导效果。但是，这些系统仅受缺氧调控，均无法达到组织特异性基因表达的目的，在治疗过程中可能对其他细胞造成损伤。用于基因治疗的载体表达要求有严格的时间和空间的特异性和可调控性。以特异性启动子控制受缺氧调控的反式作用因子的表达，并激活下游基因的表达。由此可见，可分别在空间和环境水平上对基因表达进行双重调控的载体是基因治疗载体构建领域的新思路。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种受缺氧调控的人工转录因子，它是由GAL4 DNA结合结构域与HIFlα转录激活结构域融合而成的。进一步的，该人工转录因子具有如SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。本专利技术所要解决的技术问题还在于提供一种，该载体系统由以下两个载体组成(1)含受缺氧调控的人工转录因子的载体；(2)含G5TATA启动子的载体。进一步的，本专利技术所述的受缺氧调控的人工转录因子的载体具有以下核心结构 本专利技术所述的含G5TATA启动子的载体具有以下核心结构 作为本专利技术的一个实施方式，本专利技术所述的受缺氧调控的人工转录因子的载体具有SEQ ID NO2所示的核苷酸序列；本专利技术所述的含G5TATA启动子的载体具有SEQID NO3所示的核苷酸序列。本专利技术所要解决的技术问题还在于提供一种构建的方法，该方法包括(1)运用基因工程手段，获取构建受缺氧调控的人工转录因子Gal4/HIF-ODI-TA所需片段；(2)构建pGL3/CMV-Gal-HIF-TA载体；(3)构建pGL3/G5TATA载体。本专利技术所要解决的技术问题还在于提供一种能够在缺氧组织或细胞高表达反义血管内皮生长因子asVEGF的腺病毒。作为本专利技术的一个应用方式，其可应用于制备控制血管异常增生的药物。本专利技术所要解决的技术问题还在于提供一种可特异在缺氧的血管内皮表达血管内皮生长因子VEGF的腺病毒。作为本专利技术的一个应用方式，其可应用于制备缺血性心血管疾病的药物。本专利技术所要解决的技术问题还在于提供一种能够特异在缺氧的实体肿瘤表达TNF-α的腺病毒。作为本专利技术的一个应用方式，其可应用于制备实体肿瘤的基因治疗的药物。本专利技术的是通过下述过程构建的第一步获取构建受缺氧调控的人工转录因子GAL4/HIF-ODD-TA所需片段运用基因工程手段分别通过酶切和RT-PCR方法获得GAL4 DNA结合结构域片段、HIF氧依赖降解片段和转录激活结构域片段；将上述片段分步连接入pcDNA3载体，构建pcDNA3/CMV-Gal-HIF-TA载体。第二步构建pGL3/CMV-Gal-HIF-TA载体将pcDNA3/CMV-Gal-HIF-TA载体酶切后，获得CMV-Gal-HIF-TA片段，接入去除荧光素酶LUC片段的pGL3/Basic载体，获得pGL3/CMV-Gal-HIF-TA载体。第三步构建pGL3/G5TATA载体从pG5CAT载体酶切获得G5TATA片段，接入pGL3-Basic载体，获得pGL3/G5TATA载体。本专利技术所述的能够在缺氧组织或细胞高表达反义血管内皮生长因子asVEGF的腺病毒是以反义血管内皮生长因子asVEGF替换pGL3/G5TATA载体中的LUC，获得pGL3/G5TATA-asVEGF载体，从pGL3/CMV-Gal-HIF-TA载体获得人工转录因子表达盒，与腺病毒载体连接，获得pShuttle/CMV-Gal-HIF-G5TATA-asVEGF载体，再经重组和包装制得的。本专利技术所述的可特异在缺氧的血管内皮表达血管内皮生长因子VEGF的腺病毒是以flt启动子和血管内皮生长因子VEGF，分别替换pGL3/CMV-Gal-HIF-TA载体中的CMV启动子和pGL3/G5TATA载体中的LUC基因，与腺病毒载体连接，获得pShuttle/flt-Gal-HIF-G5TATA-VEGF载体，再经重组和包装制得的。其中重组和包装采用的是本
技术人员熟知的技术。本专利技术所述的能够特异在缺氧的实体肿瘤表达TNF-α的腺病毒，它是以TRTP启动子和肿瘤坏死因子α(TNF-α)，分别替换pGL3/CMV-Gal-HIF-TA载体中的CMV启动子和pGL3/G5TATA载体中的LUC基因，与腺病毒载体连接，获得pShuttle/TRTP-Gal-HIF-G5TATA-TNF-α载体，再经重组和包装制得的。在本专利技术的制备控制血管异常增生的药物的应用中，对前述的受缺氧调控的人工转录因子的载体系统进行一定的基因工程改造以反义血管内皮生长因子asVEGF，替换pGL3/G5TATA载体的LUC，获得pGL3/G5TATA-asVEGF载体，从pGL3/CMV-Gal-HIF-TA载体获得人工转录因子表达盒，与腺病毒载体连接，获得pShuttle/CMV-al-IF-5TATA-asVEGF载体，再用常规方法制得在缺氧组织或细胞高表达反义VEGF的腺病毒，其可用于制备控制血管异常增生的药物。在本专利技术的制备缺血性心血管疾病的药物中的应用中，对前述的行一定的基因工程改造以flt启动子和血管内皮生长因子VEGF，分别替换pGL3/CMV-Gal-HIF-TA载体中的CMV启动子和pGL3/G5TATA载体中的LUC基因，与腺病毒载体连接，获得pShuttle/flt-al-HIF-G5TATA-VEGF载体，再用常规方法制得可特异在缺氧的血管内皮表达VEGF的腺病毒，其可用于制备治疗缺血性心血管疾病的药物。在本专利技术的制备实体肿瘤的基因治疗的药物中的应用中，对前述的行一定的基因工程改造以TRTP启动子和肿瘤坏死因子α(TNF-α)分别替换pGL3/CMV-Gal-HIF-TA载体中的CMV启动子和pGL3/G5TATA载体中的LUC基因，与腺病毒载体连接，获得pShuttle/TRTP-Gal-HIF和pShttle/G5TATA-TNF-α载体，再用常规方法制得可特异在缺氧的实体肿瘤表达TNF-α的腺病毒，其可用于制备治疗肿瘤的药物。与现有技术相比，本专利技术具有积极的效果和明显的优越性。由于转录因子中的GAL4 DNA结合结构域及其结合位点是酵母所特有的，在哺乳动物细胞中并不存在，因此该系统对基因表达的控制严密，人工启动子不会因为内源性转录因子的激活而产生表达的泄漏，这是对基因治疗安全性的有力保障。转录因子可改由不同启动子控制，因此赋予本专利技术所述的转录因子广阔的应用前景。许多疾病的发生与缺氧和随之而来的代谢异常，血管新生有关，同时也有许多疾病的治愈需要在缺氧条件下表达的基因产物。在本专利技术的应用中，可以用在85％以上肿瘤中表达的端粒酶逆转录酶hTERT启动子调控转录因子的表达，以自杀基因、细胞因子或凋亡基因作为下游的目的基因，可使该系统在普遍缺氧的实体瘤中表达，起到特异性杀伤肿瘤的目的；又如可用血管内皮生长因子受体flt-本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：应磊，钱关祥，卢健，戴冰冰，李锋，
申请(专利权)人：上海第二医科大学，
类型：发明
国别省市：