MHC制造技术

本文公开了使用包括锌指蛋白和切割结构域或切割半结构域的锌指核酸酶

【技术实现步骤摘要】
MHC细胞受体的靶向破坏
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求
2015
年
12
月
18
日提交的美国临时申请号
62/269,410
；
2016
年3月8日提交的美国临时申请号
62/305,097
；和
2016
年4月
29
提交的美国临时申请号
62/329,439
的权益，其公开通过引用全文纳入本文
。


[0003]本公开属于人细胞
(
包括淋巴细胞和干细胞
)
基因组修饰的领域
。

技术介绍

[0004]基因治疗对于人类治疗学的新纪元拥有巨大的潜能
。
这些方法将实现对于标准医疗实践尚未解决的病症的治疗
。
基因治疗可以包括基因编辑技术的许多变形，诸如基因座的破坏和修正，以及插入可表达的转基因，所述可表达的转基因可以通过融合该转基因的特异性外源性启动子控制，或通过存在于插入基因座位点的内源性启动子控制
。
[0005]对于这项技术任何真正实施，转基因的递送和插入是必须要解决的障碍的示例
。
例如，尽管许多基因递送方法对于治疗应用有潜在的可行性，但是它们所有都涉及安全性
、
持久性和表达水平之间大量的权衡
。
以附加体
(
例如，基础腺病毒
(Ad)、
腺相关病毒
(AAV)
和基于质粒的系统
)
提供转基因的方法通常是安全的，并且可以实现高初始表达水平，然而，这些方法缺少稳定的附加型复制，而这可能会在有丝分裂活性组织中限制表达的持续时间
。
与之相反，导致所需转基因
(
例如，整合慢病毒
(LV))
随机整合的递送方法提供了更加持久的表达，但是由于随机插入未靶向的性质，其可能会在受体细胞中引起不受调控的生长，可能经由随机整合的转基因盒附近致癌基因的活化导致恶性肿瘤
。
此外，尽管转基因整合避免了复制驱动的损失，但是其并不阻止融合转基因的外源性启动子的最终沉默
。
随着时间，这样的沉默导致针对大部分非特异性插入事件的转基因表达减少
。
另外，转基因的整合很少发生在每个靶细胞中，这可能使得感兴趣的转基因难以实现足够高的表达水平，进而实现所需的治疗效果
。
[0006]近些年间，已经开发了针对转基因整合的新策略，其利用以位点特异性核酸酶
(
例如，锌指核酸酶
(ZFN)、
转录激活因子样效应物结构域核酸酶
(TALEN)、
具有工程改造的
crRNA/tracr RNA(“单一向导
RNA”)
的
CRISP/Cas
系统来引导特异性切割等
)
和
Cfp1/CRISPR
系统的切割来引导特异性切割等
)
以偏好
(bias)
插入所选基因组基因座
。
参见，例如，美国专利号
9,255,250、9,045,763、9,005,973、8,956,828、8,945,868、8,703,489、8,586,526、6,534,261、6,599,692、6,503,717、6,689,558、7,067,317、7,262,054、7,888,121、7,972,854、7,914,796、7,951,925、8,110,379、8,409,861
；美国专利公开号
20030232410、20050208489、20050026157、20050064474、20060063231、20080159996、201000218264、20120017290、20110265198、20130137104、20130122591、
[0007]20130177983
和
20130177960
和
20150056705。
此外，靶向的核酸酶基于阿尔古
(Argonaute)
系统
(
例如，来自嗜热栖热菌
(T.thermophilus)
，称作
‘
TtAgo
’
，参见
Swarts
等
(2014)Nature 507(7491):258
‑
261)
开发，其也可具有用于基因组编辑和基因治疗的潜力
。
与经典的整合途径相比，该核酸酶介导的转基因整合途径提供了改善的转基因表达
、
增加的安全性和表达持久性的前景，因为其允许准确的转基因定位，从而使基因沉默或附近致癌基因激活的风险最小化
。
[0008]T
细胞受体
(TCR)
是
T
细胞选择性激活的主要部分
。
其具有与抗体的一些相似之处，
TCR
的抗原识别部分通常由
α
和
β
两条链构成，两者聚集形成异二聚体
。
其与抗体的相似之处在于将编码
TCR
α
和
β
复合物的单个基因组合在一起的方式
。TCR
α
(TCR
α
)
和
TCR
β
(TCR
β
)
链各自由
C
‑
末端恒定区和
N
‑
末端可变区两个区域组成
。
编码
TCR
α
和
β
链的基因组基因座与抗体编码基因座类似，所述抗体编码基因座中
TCR
α
包括
V
和
J
区段，而
β
链基因座除了
V
和
J
区段外包括
D
区段
。
对于
TCR
β
基因座，另外还存在选择过程期间选择的两个不同的恒定区
。T
细胞发育期间，各种区段重组，因而使得各
T
细胞在
α
和
β
链中包括独特的
TCR
可变部分，而这被称为互补决定区
(CDR)
，并且机体具有
T
细胞的大库，因其独特的
CDR
，其能够与通过抗原呈递细胞展示的独特的抗原相互作用
。
一旦
TCR
α
或
β
基因重排发生，第二相应
TCR<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种分离的细胞的用途，用于制备治疗患有癌症的对象的药物，其中
β2微球蛋白基因的表达通过
SEQ ID NO:2
的
69
‑
74
位或
SEQ ID NO:2
的
51
‑
57
位内的插入和
/
或缺失部分或完全灭活，其中所述插入和
/
或缺失是通过与
SEQ ID NO:10
的靶位点结合的包含锌指蛋白
ZFP
结合结构域，以及切割结构域或切割半结构域的外源性融合分子进行，所述
ZFP
包括下表单行中所示的以
F1
‑
F6
依次排列的
F1
‑
F6
的6个锌指：
2.
如权利要求1所述的用途，其还包括灭活的
T
细胞受体基因
、PD1
和
/
或
CTLA4
基因
。3.
如权利要求1或2所述的用途，其还包括编码嵌合抗原受体
(CAR)
的转基因，编码抗体
‑
偶联
T
细胞受体
(ACTR)
的转基因和
/
或编码工程改造的
TCR
的转基因
。4.
如权利要求1‑3中任一项所述的用途，其中，所述细胞是淋巴细胞
、
干细胞或祖细胞
。5.
如权利要求4所述的用途，其中，所述细胞是
T
细胞
、
诱导多能干细胞
(iPSC)、
胚胎干细胞
、
间充质干细胞
(MSC)
或造血干细胞
(HSC)。6.
如先前任一权利要求所述的用途，其中所述切割半结构域是野生型或工程改造的
FokI
切割半结构域
。7.
如权利要求1‑6任一所述的用途，其中所述外源性融合分子是锌指核酸酶
ZFN
，且作为
ZFN
对的部分使用，其中
ZFN
对中的每个
ZFN
包括以
F1
‑
F5
或
F1
‑
F6
依次排列的
F1
‑
F5
或
F1
‑
F6
的5个或6个锌指，其中所述
ZFN
对是：
ZFP
，包含
SEQ ID NO:64
的
F1,SEQ ID NO:72
的
F2,SEQ ID NO:61
的
F3,SEQ ID NO:73
的
F4,SEQ ID NO:73
的
F5,
和
SEQ ID NO:74
的
F6
，以及
ZFP
包含
SEQ ID NO:51
的
F1,SEQ ID NO:75
的
F2,SEQ ID NO:61
的
F3,SEQ ID NO:76
的
F4,SEQ ID NO:77
的
F5,
和
SEQ ID NO:78
的
F6
；
ZFP
，其包含
SEQ ID NO:64
的
F1,SEQ ID NO:72
的
F2,SEQ ID NO:61
的
F3,SEQ ID NO:73
的
F4,SEQ ID NO:73
的
F5,
和
SEQ ID NO:74
的
F6
，以及
ZFP
，其包含
SEQ ID NO:...

【专利技术属性】
技术研发人员：G，
申请(专利权)人：桑格摩生物治疗股份有限公司，
类型：发明
国别省市：