从人多能干细胞生成CD4制造技术

本文提供了用于生成CD4阳性效应T细胞和调节性T细胞的改进方法和组合物及其使用方法。法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】从人多能干细胞生成CD4
+
效应T细胞和调节性T细胞
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求于2020年10月28日提交的美国临时申请63/106,591的优先权，其公开内容通过引用以其整体并入本文。
[0003]专利技术背景
[0004]健康的免疫系统是处于平衡的系统。参与适应性免疫的细胞包括B淋巴细胞和T淋巴细胞。有两种通常类型的T淋巴细胞—效应T细胞(Teff)和调节性T细胞(Treg)。有两种通常类型的效应T细胞—T辅助(Th)细胞和细胞毒性T细胞(CTL)。表达CD4的效应T细胞通常充当Th细胞(CD4
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效应T细胞)，而表达CD8的效应T细胞通常充当CTL(CD8
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效应T细胞)。Th细胞包括Th1、Th2和Th17细胞。除了Th细胞外，非常规T细胞(例如，NK T细胞、γ/δT细胞和粘膜相关不变T细胞)也可以表达CD4。众所周知另一种独特类型的T淋巴细胞Treg表达CD4。Treg细胞调节效应T(Teff)细胞并防止过度免疫应答和自身免疫(参见例如,Romano等人,Front Imm.(2019)10:43)。传统上定义的Treg是CD4
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，但也有记载的CD8
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Treg(Yu等人,Oncology Letters(2018)15:6)。
[0005]Teff细胞在抗原攻击后的细胞介导的免疫中起着核心作用，并且可以包括幼稚、记忆、干细胞记忆或终末分化效应T细胞。Teff细胞与幼稚T细胞的区别在于经历过抗原并执行效应功能(例如，分泌细胞因子或因子以促进“辅助者”和/或细胞免疫应答)。也可以有记忆T辅助细胞或干细胞记忆T辅助细胞，它们随后也可以重新分化为辅助T效应细胞以执行效应功能。
[0006]一些Treg在胸腺中生成；它们被称为天然Treg(nTreg)或胸腺Treg(tTreg)。其他Treg是在遇到抗原后在外周生成的或在细胞培养物中生成的，被称为诱导性Treg(iTreg)或适应性Treg。Treg主动控制其他免疫细胞的增殖和激活，包括诱导耐受，通过涉及特定细胞表面受体的细胞间接触，和抑制性细胞因子如IL
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10、TGF
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β和IL
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35的分泌(Dominguez
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Villar和Hafler.,Nat Immunol.(2018)19:665
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73)。耐受性失败会导致自身免疫和慢性炎症。耐受性丧失可由Treg功能缺陷或Treg数量不足，或无应答或过度激活的Teff引起(Sadlon等人,Clin Transl Imm.(2018)7:e1011)。
[0007]近年来，人们对使用Treg治疗疾病很感兴趣。已经探索了若干方法，包括过继细胞疗法，以提高Treg的数量和功能，从而治疗自身免疫性疾病。Treg转移(递送激活和扩增的Treg群体)已在患有自身免疫性疾病(如I型糖尿病、皮肤红斑狼疮和克罗恩病)的患者和器官移植中进行了测试(Dominguez
‑
Villar,同上；Safinia等人,Front Immunol.(2018)9:354)。
[0008]在过继细胞疗法中，CD4
+
Teff细胞也越来越受到关注。已知CD4
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Teff通过优化在通过特定树突细胞和其他抗原呈递细胞(APC)的抗肿瘤或抗病原体(例如，抗病毒)启动过程中CTL的应答的幅度和质量来增强CD8
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CTL的功能性(Borst等人,Nat Rev Immunol.(2018)18:635
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47)。CD4
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Teff也被证明在HIV疾病模型中具有治疗作用(Maldini等人,Mol Ther.(2020)28(7):1585
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99)。T滤泡辅助细胞(Tfh)是CD4
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Teff的另一个子集，其通过增强B细胞应答显示出治疗前景(Kamphorst等人,Immunotherapy(2013)5(9):975
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98)。
[0009]目前，用于细胞疗法的CD4
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Teff和Treg的唯一来源是成人或青少年原代血(例如，全血或单采血液分离产品)和组织(例如，胸腺)。从这些来源分离CD4+Teff和Treg具有侵入性和耗时性，并且只能产生少量细胞，尤其是Treg。此外，从这些来源获得的CD4+Teff和Treg本质上是多克隆的，可以在其潜在的免疫抑制应答中引入可变性。还有证据表明，简单增加Treg的数量可能不足以控制疾病(McGovern等人,Front Immunol.(2017)8:1517)。
[0010]因此，仍然需要有效地大量获得抗原特异性CD4
+
Teff和Treg细胞，尤其是基因工程改造的细胞。

技术实现思路

[0011]本公开提供了获得富含CD4
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T细胞的细胞群的方法，包括提供CD4
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CD8
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未成熟T细胞的起始群，在包含佛波醇12
‑
十四酸酯13
‑
乙酸酯(PMA)和离子霉素(I)的培养基中培养细胞群，从而获得富含CD4单阳性T细胞的细胞群。在一些实施方案中，CD4单阳性T细胞是未成熟的CD4
+
T细胞，任选地其中T细胞表达ThPOK。在某些实施方案中，未成熟的CD4
+
T细胞是效应T(Teff)细胞，任选地其中Teff细胞是CD25
低
。
[0012]在一些实施方案中，培养基包含约0.00625μg/ml至约0.1μg/ml PMA和约0.125μg/ml至约2μg/ml离子霉素。在进一步的实施方案中，培养基包含0.00625μg/ml PMA和0.125μg/ml离子霉素。在一些实施方案中，培养基中PMA与离子霉素的重量比为约1:10至1:1000(例如，1:20、1:50、1:100、1:200、1:250或1:500)。在某些实施方案中，该比率为1:20。
[0013]在一些实施方案中，CD4
+
CD8
+
T细胞的起始群体在培养基中培养约一至五天。
[0014]在一些实施方案中，本公开提供了获得富含CD4
+
T细胞(例如，人细胞)的细胞群的方法，包括提供CD4
+
CD8
+
T细胞的起始群，在包含佛波醇12
‑
十四酸酯13
‑
乙酸酯(PMA)和离子霉素(I)的培养基中培养细胞群，从而获得富含CD4单阳性T细胞的细胞群，在包含IL
‑
2、抗CD2抗体、抗CD3抗体和抗CD28抗体的第二培养基中培养CD4单阳性T细胞(例如，持续约5
‑
10天)，从而获得富含CD4
+...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.获得富含CD4单阳性T细胞的细胞群的方法，所述方法包括：提供CD4
+
CD8
+
T细胞的起始群体，在包含佛波醇12
‑
十四酸酯13
‑
乙酸酯(PMA)和离子霉素的培养基中培养所述细胞的起始群体，从而获得富含CD4单阳性T细胞的细胞群。2.权利要求1的方法，其中所述培养基含有0.00625μg/ml至0.1μg/ml PMA和0.125μg/ml至2μg/ml离子霉素。3.权利要求1或2的方法，其中PMA与离子霉素的重量比为1:10至1:1000，任选地为1:20。4.权利要求3的方法，其中所述培养基包含0.00625μg/ml PMA和0.125μg/ml离子霉素。5.权利要求1
‑
4中任一项的方法，其中所述细胞在所述培养基中培养约一至五天。6.权利要求1
‑
5中任一项的方法，其中所述CD4单阳性T细胞是未成熟的CD4
+
T细胞，任选地其中所述T细胞表达ThPOK。7.权利要求6的方法，其中所述未成熟CD4
+
T细胞是效应T(Teff)细胞，任选地其中所述Teff细胞是CD25
低
。8.权利要求1
‑
6中任一项的方法，其进一步包括在包含TGF
‑
β和全反式视黄酸(ATRA)的第二培养基中培养所述CD4单阳性T细胞，从而获得富含CD4
+
调节性T(Treg)细胞的细胞群。9.权利要求8的方法，其中所述第二培养基还包含IL
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2、抗CD2抗体、抗CD3抗体和抗CD28抗体。10.权利要求8的方法，其中所述第二培养基包含T细胞特异性培养基，以及TGF
‑
β、ATRA、IL
‑
2、抗CD2抗体、抗CD3抗体和抗CD28抗体中的一种或多种。11.权利要求8
‑
10中任一项的方法，其中所述CD4单阳性T细胞在所述第二培养基中培养约5
‑
10天。12.权利要求1
‑
11中任一项的方法，其进一步包括通过荧光激活细胞分选(FACS)或磁激活细胞分选(MACS)从组织培养物中分离所述CD4单阳性Teff或Treg细胞。13.权利要求1
‑
11中任一项的方法，其进一步包括通过荧光激活细胞分选(FACS)从组织培养物中分离所述CD4单阳性Teff或CD4
+
CD25
+
CD127
低
Treg细胞。14.权利要求1
‑
11中任一项的方法，其进一步包括通过FACS从组织培养物中分离CD4
+
CD25
高
CD127
低
和CD4
+
CD25
低
CD127
低
Treg细胞。15.权利要求1
‑
14中任一项的方法，其中所述CD4
+
CD8
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T细胞的起始群体衍生自人诱导多能干细胞(iPSC)。16.权利要求15的方法，其中所述iPSC从T细胞重编程。17.权利要求15或16的方法，其中所述iPSC在基因组中包含异源序列，其中所述异源序列包含编码谱系定型因子的转基因，并且其中所述谱系定型因子(i)促进所述iPSC分化为CD4
+
Teff细胞或(ii)促进所述iPSC分化为CD4
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Treg细胞和/或促进所述CD4
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【专利技术属性】
技术研发人员：H，
申请(专利权)人：桑格摩生物治疗股份有限公司，
类型：发明
国别省市：