用于阻遏TAU表达的锌指蛋白转录因子制造技术

本公开提供了抑制神经系统中tau表达的锌指融合蛋白，以及使用该蛋白质治疗神经退行性疾病诸如阿尔茨海默病、额颞叶痴呆和其他tau蛋白病的方法。蛋白病的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于阻遏TAU表达的锌指蛋白转录因子
[0001]对相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2020年1月22日提交的美国临时申请62/964,501的优先权。上述临时申请的内容通过引用其整体并入本文。
[0003]序列表
[0004]本申请含有序列表，该序列表已经以ASCII格式电子提交，并通过引用整体并入本文。所述ASCII副本创建于2021年1月19日，命名为025297_WO016_SL.txt，并且大小为304,337字节。
[0005]专利技术背景
[0006]微管相关蛋白tau(MAPT)，也称为tau，在某些脑病理学中起重要作用。错误折叠的tau聚集成神经原纤维缠结(NFT)和其他病理性tau包涵物牵涉许多神经退行性疾病，统称为tau蛋白病。这些包括阿尔茨海默病(AD)、额颞叶痴呆(FTD)、进行性核上性麻痹(PSP)、难治性遗传性癫痫(例如Dravet综合征)、创伤性脑损伤(TBI)、皮质基底节变性(CBD)和慢性创伤性脑病(CTE)。参见，例如，Benussi et al.,Front Aging Neurosci.(2015)7:171；Gheyara et al.,Ann Neurol.(2014)76:443
‑
56；Scholz and Bras,Int J Mol Sci.(2015)16(10):24629
‑
55；和McKee et al.,Brain Pathol.(2015)25(3):350
‑
64。
[0007]已经表明tau具有朊病毒样特性。几项研究显示，tau的过度磷酸化可以导致tau错误折叠。错误折叠的tau聚集体可以扩散遍及脑(Takeda et al.,Nat Comm.(2015)6:8490；Hyman,Neuron(2014)82:1189；de Calignon et al.,Neuron(2012)73:685
‑
97)。这些聚集体可能是在tau蛋白病中发现的NFT形成的初始步骤。尽管NFT在AD早期仅限于内嗅皮层和内侧颞叶，但等到出现严重的临床症状，NFT在整个脑中广泛遍布。在患有AD的患者中发现NFT和β淀粉样蛋白斑块，并且已显示淀粉样蛋白沉积增加tau病理学和远端脑区中的沉积(Bennett et al.,Am J Pathol.(2017)187(7):1601
‑
12)。区域tau累积和扩散与啮齿动物模型和人疾病中的神经元损失密切相关(Pooler et al.,Acta Neuropathol Commun.(2015)3:14；La Joie et al.,Sci Transl Med.(2020)。除了聚集的tau的累积产生的神经毒性外，tau的可溶性寡聚形式似乎也具有毒性(Guerrero
‑
Munoz et al.,Front Cell Neurosci.(2015)9:464)。可溶性错误折叠的内源性tau似乎在各种神经元应激条件下作为神经毒性的介质发挥作用。
[0008]已显示内源性tau的减少对不同遗传小鼠模型中的AD样病理学有益(Roberson et al.,Science(2007)316:750
‑
4；DeVos et al.,Sci TranslMed.(2017)9(374):eaag0481；Wegmann et al.,EMBO J.(2015)1
‑
14)。降低脑中的tau水平似乎也可以保护免受应力诱导和癫痫发作诱导的神经元损伤，以及免受因创伤性脑损伤导致的学习和记忆缺陷(Lopes et al.,PNAS(2016)113:e3755
‑
63；Gheyara,，同上；DeVos et al.,JNeurosci.(2013)33(31):12887
‑
97；Cheng et al.,PLoS One(2014)9(12):e115765)。然而，目前还没有对tau蛋白病的有效治疗。已通过施用结合tau mRNA并阻止其翻译的反义寡核苷酸(ASO)(DeVos(2017)同前；DeVos et al.,Neurotherapeutics(2013)10(3):486
‑
97)或通过静脉注射抗tau抗体(Asuni et al.,JNeurosci.(2007)27:9115
‑
29；Ittner et al.,JNeurochem.
(2015)132:135
‑
45；Herrmann et al.,J Neurochem.(2015)132:1
‑
4；Yanamandra et al.,Neuron(2013)80(2):402
‑
14)来实现体内tau敲低。尽管这两种方法均可以促进脑中tau蛋白的减少，但它们需要在患者的一生中长期施用。抗体具有差的血脑屏障和细胞膜通透性，这可能限制它们在中枢神经系统内的扩散以及它们接合神经元内tau的能力。此外，抗tau抗体治疗剂的开发一直很困难，因为致病性tau种类的身份和数量目前是未知的，并且在tau蛋白病中可能变化。
[0009]鉴于tau在脑病理学中的显著作用和有效治疗的缺乏，迫切需要开发靶向这种蛋白质的治疗剂用于预防和治疗tau蛋白病，包括AD。

技术实现思路

[0010]本公开提供了靶向人MAPT基因中或附近的位点的锌指蛋白(ZFP)。本公开的ZFP可以与转录因子融合以在DNA水平上特异性抑制微管相关蛋白tau(MAPT)基因的表达。这些融合蛋白含有(i)与MAPT基因中的靶区特异性结合的ZFP结构域和(ii)至少一个减少基因转录的转录阻遏物结构域。
[0011]在一个方面，本公开提供了融合蛋白，其包含锌指蛋白(ZFP)结构域和转录阻遏物结构域，其中ZFP结构域结合至人MAPT基因的靶区。在一些实施方案中，靶区在MAPT基因中的转录起始位点(TSS)的1.5kb内，例如，在MAPT基因的TSS上游的1000bp内，和/或TSS下游的500bp内。
[0012]在一些实施方案中，ZFP结构域包含一个或多个(例如，一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个)锌指，并且融合蛋白任选地阻遏MAPT基因的表达至少约40％、75％、90％、95％或99％，任选地没有或具有最小的通过众所周知的方法可检测的脱靶结合或活性(例如，与不是MAPT基因的基因结合)。本ZFP的DNA结合识别螺旋氨基酸序列的非限制性实例显示于图14或图16中。在一些实施方案中，融合蛋白包含图14或图16中所示的一个或多个识别螺旋序列。在进一步的实施方案中，融合蛋白包含图14或图16中单行中所示的一些或全部识别螺旋序列，具有或不具有图16中所示的指定主链突变。在某些实施方案中，融合蛋白包含图15或图17中所示的氨基酸序列。
[0013]在一些实施方案中，本融合蛋白的转录阻遏物结构域包含KRAB结构域本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.融合蛋白，其包含锌指蛋白(ZFP)结构域和转录阻遏物结构域，其中所述ZFP结构域结合至人微管相关蛋白tau(MAPT)基因的靶区。2.权利要求1所述的融合蛋白，其中所述靶区在所述MAPT基因中的转录起始位点(TSS)的1.5kb内。3.权利要求2所述的融合蛋白，其中所述靶区在所述MAPT基因的所述TSS上游的1000bp内，和/或所述TSS下游的500bp内。4.前述权利要求中任一项所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白阻遏所述MAPT基因的表达至少约40％、75％、90％、95％或99％，而没有可检测的脱靶结合或活性或具有最小的可检测的脱靶结合或活性。5.前述权利要求中任一项所述的融合蛋白，其中所述转录阻遏物结构域包含KRAB结构域，其中所述KRAB结构域任选地来自人KOX1蛋白。6.前述权利要求中任一项所述的融合蛋白，其中所述DNA结合结构域通过肽接头与所述转录阻遏物连接。7.前述权利要求中任一项所述的融合蛋白，其中所述ZFP结构域包含图14或图16中所示的DNA结合识别螺旋序列。8.前述权利要求中任一项所述的融合蛋白，其中所述ZFP结构域包含如图14或图16的单行中所示的所述DNA结合识别螺旋序列。9.前述权利要求中任一项所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白的所述ZFP结构域包含四个、五个或六个锌指；结合至图14或图16中所示的靶序列；包含图15或图17中所示的ZFP转录因子的DNA结合识别螺旋序列；包含如图14、图15、图16或图17中所示连接的DNA结合识别螺旋序列；和/或包含选自SEQ ID NO:89
‑
196、197
‑
248和267
‑
307的氨基酸序列。10.核酸构建体，其包含权利要求1
‑
9中任一项所述的融合蛋白的编码序列，其中所述编码序列与转录调节元件可操作地连接。11.权利要求10所述的核酸构建体，其中所述转录调节元件是在脑细胞中组成型活性或可诱导的哺乳动物启动子，其中所述构建体任选地是重组病毒构建体。12.重组病毒，其包含权利要求10或11所述的核酸构建体。13.权利要求12所述的重组病毒，其中所述重组病毒是腺相关病毒载体、腺病毒载体或慢病毒载体。14.药物组合物，其包含权利要求10或11所述的核酸构建体，或权利要求12或13所述的重组病毒，以及药学上可接受的载体。15.宿主细胞，其包含权利要求1...

【专利技术属性】
技术研发人员：B蔡特勒，A哈塔米，L张，
申请(专利权)人：桑格摩生物治疗股份有限公司，
类型：发明
国别省市：